抗菌肽LL-37对患结肠炎小鼠肠黏膜屏障的保护功能

韩菲菲 杨莎莎 赵 霞 丁梦露 韩剑众

（浙江工商大学食品与生物工程学院 浙江省食品安全重点实验室 杭州310018）

炎症性肠病（Inflammatory bowel diseases，IBDs）是一种反复发作的肠道慢性炎症性疾病，包括溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis，UC）和克罗恩病（Crohn’s disease，CD）2 大类。目前，对IBDs 的具体病因尚不明确，免疫、营养以及环境等因素共同作用导致IBDs 发生或病程延长[1]。大量研究已证实机体自身免疫的驱动因素对IBDs 发病有重要影响[2]。抗生素和益生素能够改善IBDs 临床症状[3]。IBDs 典型病理特征之一是肠黏膜屏障功能受损[4]。维持肠黏膜屏障的完整性对肠道内环境的稳定极其重要。

抗菌肽是宿主黏膜表面防御的一类重要分子，其中防御素和cathelicidins是哺乳动物抗菌肽的2 大家族[5]。早期抗菌肽被定义为可杀灭致病性微生物。越来越多的新证据表明，这些肽在宿主防御方面发挥重要的作用。Cathelicidines 家族抗菌肽拥有复杂的受体介导功能，参与细胞增殖和迁移、免疫调节、伤口愈合以及血管新生等生理过程，被认为是维持肠道屏障功能和免疫平衡的重要物质[6]。LL-37（又称hCAP-18）是目前人体内发现的唯一的cathelicidins 家族抗菌肽。有研究证实LL-37 与IBDs 发病原因密切联系；其在IBDs 患者体内正常或炎症性肠段黏膜中的调节表达是有区别的；UC 患者炎症性肠组织中LL-37 的表达较CD 患者明显升高[7]。虽有研究发现丁酸盐、维生素D等通过调节cathelicidin 家族抗菌肽基因表达或分泌缓解IBD 症状[3]，然而cathelicidin 家族抗菌肽LL-37 对炎症性肠病的影响机制尚不明确，LL-37是否能通过对肠道屏障施加保护缓解炎症性肠病的症状需进一步研究。本研究在建立急性溃疡性结肠炎小鼠模型的基础上，探讨LL-37 在维持和重建肠黏膜屏障完整性方面的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂

体重18～22 g 雄性清洁级C57BL/6 小鼠40只，由杭州师范大学实验动物中心提供并饲养；动物房温度（20±2）℃，湿度50%，每日光照12 h，由杭州师范大学实验动物中心提供标准日粮。硫酸葡聚糖钠（DSS，分子质量36 000～50 000 u），购于MP 公司；LL-37（氨基酸序列LLGDFFRKSK EKIGKEFKRI VQRIKDFLRNLVPRTES），委托吉尔生化（上海）有限公司合成，纯度>95%；ELISA检测试剂盒，购于联科生物技术股份有限公司。免疫组化抗体，购自博士德生物工程有限公司。Primer Express 2.0 软件设计小 鼠claudin-1（F：5′-AGTAACTTTGCCATAAGACCA-3′；R：5′-AAAGTGCAAAGACCGTC-3′），occludin（F：5′-ACTGGGTCAGGGAATATCCA - 3 ′；R ：5 ′ -TCAGCAGCAGCCATGTACTC -3′），ZO-1（F：5′-TCATCCCAAATAAGAACAGAGC -3′；R：5′ -GAAGAACAACCCTTTCATAAGC-3′），GAPDH（F：5' -GGTGAAGGTCGGTGTGAACG -3′；R：5′ -CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3′）基因引物并委托上海生物工程有限公司合成。荧光定量PCR 所用试剂购自Roch 公司。

1.2 试验方法

1.2.1 动物实验设计 将40 只小鼠随机分为4组：C 组（正常饮水）、DSS 组（饮用3%DSS 水）、DL组（饮用3%DSS 水）和LL 组（正常饮水），小鼠自由采食和饮水，试验期共8 d；试验结束后，眼眶后静脉丛取血，静置离心取血清，-80 ℃保存备用；处死小鼠后，取新鲜结肠段用于跨上皮电阻测定；部分结肠组织固定于4%多聚甲醛溶液中用于后续石蜡包埋及组织切片；剩余结肠组织液氮冻存用于后续荧光定量PCR 检测。

1.2.2 疾病活动指数（Disease activity index，DAI）每日观测小鼠体增重、粪便性状、粪便隐血情况并评分[8]，根据上述3 项评分计算小鼠疾病活动指数。

1.2.3 结肠组织切片及HE 染色 参考文献[9]方法，取多聚甲醛溶液中固定好的结肠肠段进行脱水→透蜡→包埋→切片→贴片→染色→透明→封藏等过程制作组织切片并进行HE 染色，光学显微镜下观察结肠组织结构。

1.2.4 免疫组化法分析结肠组织免疫细胞炎性浸润 将结肠石蜡切片进行脱蜡、梯度酒精复水、抗原修复封闭、一抗（CD177 兔抗鼠单克隆抗体、CD68 兔抗鼠单克隆抗体兔抗鼠单克隆抗体）和二抗（羊抗兔IgG-HRP）孵育、DAPI 显核、甘油封片等过程后，在光镜下观察结肠组织炎性细胞浸润情况，利用Image pro-plus 6.0 软件分析；选取相同的棕黄色作为判断所有阳性染色的统一标准，对每张照片进行分析得出阳性细胞的累积光密度值（IOD）；每组所有照片的平均值代表该组的IOD值（Mean±SEM 表示）。

1.2.5 ELISA 检测血清炎性细胞因子及肠型脂肪酸结合蛋白（I-FABP2）质量浓度 取血并离心获得各组小鼠血清，按试剂盒说明书测定血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 以及I-FABP2 含量。

1.2.6 尤斯室法检测小鼠结肠通透性 将新鲜结肠组织固定于蜡板上，剥离粘膜组织并固定于尤斯室灌流系统的样品室，两侧室各注入3 mL 氧合Kerbs 缓冲液，温度维持在37 ℃。调节电压钳零电压，以1 mV 刺激电压每隔60 s 刺激0.5 s，按说明书步骤操作并记录跨上皮电阻（Trans-epithelial electrical resistance，TEER）。

1.2.7 Real time PCR 检测紧密连接蛋白表达水平 Trizol 法提取结肠组织总RNA，按照M-MLV反转录酶（cDNA）合成试剂盒操作说明进行反转录后，以GAPDH 为内参基因，实时荧光定量PCR法检测基因表达水平差异；实时荧光定量PCR 操作步骤按SYBRRPremix Ex TaqTM说明书进行；反应流程为95 ℃预变性30 s，进入循环流程：95℃变性10 s，60 ℃退火34 s，反应40 个循环。基因的相对表达水平以2-△△Ct进行分析，其中△Ct =目的基因Ct-内参基因Ct；△△Ct =试验组△Ct-对照组△Ct。

1.3 统计学方法

SPSS 18.0 软件进行数据的统计分析，数据以Mean±SEM 表示；组间比较采用单因素方差分析。* 代表P<0.05，为有统计学意义的显著差异。

2 结果

2.1 LL-37 对溃疡性结肠炎小鼠疾病活动指数（DAI）的影响

试验期内C 组和LL 组小鼠的体重、粪便性状、粪便隐血情况评分接近正常水平，DAI 介于0～1 之间（图1）；DSS 组小鼠的各项评分随时间延长逐渐升高，至试验结束时DAI 超过2，而DL 组小鼠各项评分较DSS 组小鼠相比均显著降低，至试验第7 天，各项评分均接近C 组，表明腹腔注射LL-37 明显缓解了DSS 导致的小鼠体重降低、腹泻以及肠道出血等症状，有效降低了小鼠DAI。

2.2 LL-37 对小鼠结肠组织结构的影响

光学显微镜下观察小鼠结肠组织切片（图2），C 组和LL 组小鼠结肠组织层次结构清楚，形态正常，黏膜层完整。腺体排列整齐、紧密；隐窝形态正常，黏膜层可见大量杯状细胞；高倍镜下可见肠上皮细胞形态正常，固有膜内以淋巴细胞和浆细胞为主。DSS 组小鼠结肠组织损伤主要以黏膜层和黏膜下层为主；病变部位组织肿胀，层次欠清，黏膜层腺体广泛破坏，肠上皮细胞排列紊乱，杯状细胞几乎不可见，黏膜层缺损较重。而DL 组小鼠的结肠黏膜较完整，隐窝结构基本正常，肠上皮细胞排列已明显恢复。

图2 小鼠结肠组织形态（×200，HE 染色）Fig.2 Histomorphological structure of the colon tissue（×200，H&E-stained sections）

2.3 LL-37 对小鼠结肠组织通透性的影响

ELISA 法检测小鼠血液中肠型脂肪酸结合蛋白（I-FABP2）质量浓度结果（图3）揭示DSS 组小鼠血液中I-FABP2 质量浓度显著高于C 组小鼠（P<0.05），提示该组小鼠结肠机械屏障受到破坏；与DSS 组相比，DL 组小鼠血液中I-FABP2 质量浓度有所降低（P<0.05），表明LL-37 在维持小鼠结肠正常通透性中发挥重要作用。

图3 LL-37 对小鼠血清肠型脂肪酸结合蛋白的影响（＊P<0.05）Fig.3 Effect of LL-37 on I-FABP2 level in mice serum（*P<0.05）

图4 LL-37 对小鼠结肠跨膜电阻的影响Fig.4 Effect of LL-37 on colonic transepithelial electrical resistance of mouse

利用尤斯室法对各组小鼠新鲜结肠通透性分析结果（图4）表明，与C 组相比，LL 组小鼠结肠的跨上皮电阻变化不大，揭示正常小鼠腹腔注射LL-37 对其结肠组织的通透性影响较小；而DSS组小鼠结肠组织在剖取新鲜组织后0～60 min 内的跨上皮电阻均显著降低，表明结肠组织通透性增大是DSS 诱导小鼠溃疡性结肠炎的主要症状之一；与DSS 组相比，DL 组小鼠结肠的跨上皮电阻则明显回升，表明腹腔注射LL-37 明显缓解了DSS 诱导的小鼠结肠组织通透性增加的症状。

2.4 LL-37 对小鼠结肠免疫细胞炎性浸润程度的影响

免疫组化法特异性标记结肠组织嗜中性粒细胞和巨噬细胞的结果表明，DSS 组小鼠结肠组织中的噬中性粒细胞（CD177+）和巨噬细胞（CD68+）数量与C 组相比均显著增加（P<0.05），表明DSS组小鼠结肠黏膜存在明显的中性粒细胞和巨噬细胞炎性浸润现象；与DSS 组相比，DL 组小鼠结肠中的噬中性粒细胞和巨噬细胞数量则发生了显著降低（P<0.05），表明腹腔注射LL-37 能够显著缓解DSS 诱导的小鼠结肠组织免疫细胞的炎性浸润，这可能与LL-37 明显缓解小鼠肠道炎症、溃疡等症状密切相关。

图5 LL-37 对结肠嗜中性粒细胞炎性浸润的影响（×400，CD177+细胞）Fig.5 Effects of LL-37 on the infiltration of neutrophilic granulocyte（×400，CD177+ cells）

图6 LL-37 对结肠巨噬细胞炎性浸润的影响（×400，CD68+细胞）Fig.6 Effects of LL-37 on the infiltration of macrophagocyte（×400，CD68+cells）

2.5 LL-37 对小鼠结肠组织细胞因子分泌水平的影响

ELIAS 试验检测各组小鼠血清中IL-1β，IL-6，TNF-α 分泌水平（图7）的结果表明，与C 组相比，腹腔注射LL-37 对小鼠血清IL-1β，IL-6，TNF-α 分泌水平未产生显著影响（P>0.05），而DSS 组小鼠血清中IL-1β，IL-6，TNF-α 分泌量均显著增加（P<0.05）；与DSS 组相比，DL 组小鼠血清 中IL-1β，IL-6，TNF-α分泌水平均显著降低（P<0.05）。

图7 LL-37 对结肠细胞因子分泌水平的影响Fig.7 Effect of LL-37 on the secretion level of inflammatory cytokines

2.6 LL-37 对小鼠结肠紧密连接蛋白基因表达水平的影响

荧光定量PCR 法比较各组小鼠结肠紧密连接蛋白mRNA 表达情况（图8 的）结果表明，与对照组小鼠相比，DSS 组小鼠3种紧密连接蛋白mRNA 水平均显著降低（P<0.05），而其中水闸蛋白-1 和闭锁小带蛋白-1 mRNA 在DL 组的表达水平与DSS 组相比均显著增加（P<0.05）。

图8 LL-37 对水闸蛋白-1、闭锁蛋白和闭锁小带蛋白-1 3种紧密连接蛋白mRNA 表达水平的影响Fig.8 Effect of LL-37 on the mRNA expression level of claudin-1，occludin and ZO-1

3 讨论

肠黏膜屏障在预防有害微生物和毒素侵入机体方面发挥重要作用。肠上皮组织损伤导致的肠黏膜屏障破坏以及随之而来的炎症反应都是溃疡性结肠炎的显著特点。因此，抵御入侵的病原体和修复肠道屏障是重建肠道内环境稳态必不可少的要素。抗菌肽在上皮组织屏障保护方面的作用已被前期大量研究所证实。研究揭示，与LL-37 属同源的小鼠cathelicidin 基因被敲除后，肠腔内的人工移植菌群发生显著改变，揭示了其在维持肠道环境稳态方面具有重要作用[10]。目前在人类胎粪及新生儿粪便中都检测到了LL-37 的存在，也有研究证实了其与皮肤上皮组织和血管再生有密切关系[11]，但缺少LL-37 修复肠黏膜屏障功能方面的证据。本研究以DSS 诱导的溃疡性结肠炎小鼠为模型，评价了LL-37 在保护肠黏膜屏障方面的功能。

正常肠黏膜屏障由机械屏障、化学屏障、免疫屏障与生物屏障4 部分共同构成，任何一个环节的缺损都会影响肠黏膜屏障功能[12]。TEER是体外评价肠道机械屏障的常用指标，能直接反映肠黏膜屏障的完整性[13]。此外，I-FABP 作为肠道上皮细胞的特异性标志蛋白之一，正常情况下在血液中含量极微；当肠黏膜受损、屏障功能发生障碍时，I-FABP 会透过肠道屏障入血。本研究结合TEER 和I-FABP2 质量浓度证明了LL-37 在缓解DSS 对结肠组织通透性的破坏，保护肠道机械屏障功能方面的作用。

肠道机械屏障能有效阻止细菌穿透黏膜进入深部组织，是肠黏膜屏障的结构基础。上皮细胞间的紧密连接由多种功能各异的蛋白质组成。UC 发病时肠黏膜屏障通透性增加以肠上皮细胞旁路的通透性明显增高为特征；而肠上皮细胞旁路的通透性主要受紧密连接（Tight junction，TJ）限制[14]。现已发现40 多种肠黏膜上皮细胞TJ 的相关蛋白质，主要有闭锁蛋白（occludin）、水闸蛋白（claudin）、闭锁小带蛋白（Zonula occludens，ZOs）；TJ 蛋白在肠黏膜上皮细胞的表达下降，表明肠黏膜屏障通透性增高，肠黏膜屏障功能受损。本研究显示DSS组小鼠肠上皮组织受损，同时水闸蛋白-1、闭锁蛋白、闭锁小带蛋白-1 基因表达量显著降低，说明肠上皮屏障功能严重破坏，是UC 典型的表现。在DSS 诱导结肠炎的同时给予腹腔注射LL-37 则能够减少因DSS 破坏导致的几种紧密连接蛋白基因表达水平降低，从而有效缓解结肠机械屏障功能受到破坏。

肠黏膜的防御作用被认为是执行局部特异性免疫功能的主要场所[15]。肠黏膜屏障功能缺陷时，微生物抗原可以进入肠黏膜固有层，从而诱导效应T 细胞活化，启动黏膜免疫反应；CD4+T 细胞作为肠黏膜炎症反应的主要效应细胞，其分泌的白细胞介素-17（IL-17）具有强大的募集和激活嗜中性粒细胞的能力，能诱导活化T 细胞产生多种促炎介质IL-1β，IL-6，TNF-α等而诱发加重炎症反应[16]。本研究结果表明DSS 组小鼠结肠黏膜屏障受到破坏后，IL-1β，IL-6，TNF-α 浓度显著增加，而同时腹腔注射LL-37 则明显缓解了这些炎性细胞因子浓度的升高，从而减轻肠黏膜的炎症反应。炎性细胞浸润被认为是引起肠黏膜破坏的重要原因[17]。在免疫组化分析中，DSS 组小鼠结肠嗜中性粒细胞和巨噬细胞数量明显增加，这与结肠组织切片的结果相一致；给予LL-37 能够使结肠免疫细胞的炎性浸润程度大大减轻。

4 结论

本研究结果揭示LL-37 能够通过调节肠道通透性、跨上皮电阻、紧密连接蛋白表达等方式来缓解DSS 对小鼠结肠机械屏障的破坏，通过抑制促炎细胞因子的分泌来缓解结肠的炎症反应，实现对肠黏膜屏障的保护作用。