T2 毒素单克隆抗体及试剂盒的制备

方勤美 刘建龙 陈永聪 柯 翎 郑在予 陈秀霞 龚 晖

（福建省农业科学院生物技术研究所 福州 350003）

T2 毒素属于A 型单端孢霉烯族化合物，主要由三线镰刀、枝孢镰刀菌、拟枝孢镰刀菌、梨孢镰刀菌和硫色镰刀菌等真菌代谢产生[1]。 食物和饲料中经常检测真菌毒素，其中T2 毒素最强，是蛋白质合成的强抑制剂[2]。 研究证明[3]，T2 毒素可在体内产生更强的毒素物质，目前没有有效的治疗手段，对人类食物、动物饲料及健康具有潜在危害，唯有预防监测是唯一有效管控途径。 所以，建立一套灵敏、快捷的检测方法已成为近年来的研究热点。

目前，已有气相色谱法[4]、气相色谱串联质谱法[5]、高效液相色谱法[6]和液相色谱串联质谱法[7]等用于T2 毒素检测， 但这些方法需具备相关仪器和专业人员，检测成本昂贵，建立一套更简便实用的方法尤为重要。本试验制备单克隆抗体，并建立酶联免疫吸附试验方法， 为食品和动物饲料中检测T2 奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 T2 毒素免疫原为本室合成并保存。6～8 周龄BALB/c 小鼠购自北京，羊抗鼠的IgG、牛血清白蛋白(BSA)、96 孔板条、PBS 缓冲液购自SIGMA公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫与细胞融合 按经典程序免疫BALB/c小鼠。选出1 号小鼠进行细胞融合试验后，45%细胞培养孔中长出杂交瘤细胞株， 用间接非竞争性ELISA 筛选，并用间接竞争法确证，从中选择出一株效价高又能被T2 毒素强抑制的杂交瘤细胞，经3 次克隆化后，克隆阳性率达100%，将其冻存于液氮罐中。

1.2.2 T2-OVA 板孔的制备 将T2-OVA 用CBS缓冲液稀释至0.06 ug/mL，充分混匀后，在96 孔板的每孔中加入50 uL，37 ℃温育2 h， 用PBST 洗板4 次，每次间隔3 min；拍干后加满封闭液，4 ℃封闭过夜，洗板；晾干后将板条密封置于冰箱保存，备用。

1.2.3 抗体效价测定 采用间接ELISA 测定小鼠的血清效价。 取经包被好的T2-OVA 板孔，每孔中加入50 uL 无菌PBS，然后自第一排依次加入50 uL小鼠血清，倍比稀释至倒数第2 排，最后1 排为空白对照，37 ℃孵育20 min， 用洗液洗板3 次； 每孔加50 uL 羊抗鼠酶标二抗，37 ℃孵育20 min，用洗液洗板5 次；每孔加50 uL 显色液，室温振荡反应10 min；每孔加入50 uL 终止液，用酶标仪读取OD450值。

1.2.4 抗体对T2 毒素半数抑制浓度（IC50） 的测定采用间接竞争ELISA 鉴定单克隆抗体对T2 毒素半数抑制浓度（IC50）。 具体操作如下：加不同浓度的T2毒素标准品溶液50 uL 作为抑制剂；加T2 毒素单克隆抗体50 uL， 反应20 min， 用洗液洗板3 次；每孔加50 uL 羊抗鼠酶标二抗，37 ℃孵育20 min，用洗液洗板5 次；每孔加50 uL 显色液，室温振荡反应10 min； 每孔加入50 uL 终止液， 用酶标仪读取OD450值。1.2.5 T2 毒素检测试剂盒的制备 试剂盒方法采用竞争法测抗原， 板孔底部包被羊抗鼠的IgG （二抗），利用T2 毒素的单克隆抗体既可以与底部包被二抗结合又可与自身抗原（T2 毒素）结合的特点，将其固定在板孔底部的同时， 使标准品或待测物与酶标抗原与其竞争结合。洗去游离的物质后，固相上的酶量与标准品或待测物为一定的比例关系， 加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与酶量呈正相关， 与标准品或待测物的量呈负相关，故可根据颜色的深浅进行定性或定量分析。

2 结果与讨论

制备的腹水效价为1:1.024×106，纯化后的抗体效价为1:5.76×105。 抗体活性保持良好。

2.1 单克隆抗体效价测定 结果判定标准：待测孔OD450值/空白孔OD450值≥2.1，判定该抗体效价为1:5.76×105。 表1 结果显示，抗体效价达到1:36 000。

2.2 筛选合适的单克隆抗体 计算出抑制率B/B0的值（B0为不加T2 毒素标准品时的吸光值，B 为加不同质量浓度T2 毒素标准品的吸光值），以B/B0的结果为纵坐标，以T2 毒素质量浓度（ng/mL）的对数值为横坐标， 绘制T2 毒素对小鼠多抗血清的抑制曲线，根据绘制的标准曲线推导出回归方程，计算出小鼠多抗血清对T2 毒素的半数抑制浓度(IC50)为2.0 ng/mL，见图1、表2-表3。

图1 T2 毒素半数抑制浓度（IC50）测定抑制曲线

经综合分析， 选择酶标抗原稀释12 000 倍、抗体稀释2 000 倍的组合为宜。

2.3 抗体对T2 毒素半数抑制浓度（IC50）的测定 从表4 结果可知， 抗体对T2 毒素半数抑制浓度（IC50）为8.96 ng/mL。

表1 抗体效价测定

表2 小鼠多抗血清对T2 毒素半数抑制浓度(IC50)的测定

表3 单克隆抗体与酶标记物配比测定

表4 抗体对T2 毒素半数抑制浓度（IC50）的测定

2.4 用试剂盒进行测试 从表5 结果可知，该试剂盒的灵敏度和回归率效果都很好， 试剂盒可用于大量样本的测评。

表5 试剂盒测评