PRRSV 不同毒株RT-PCR 检测方法的建立与应用

饶云萍 兆丰华生物科技（福州）有限公司 福州 350014

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS），是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种以母猪流产、早产、死胎和木乃伊胎，仔猪和育肥猪发生呼吸道疾病为特征的传染病[1]。1987 年美国首次报道该病，随后欧洲和亚洲等地区陆续报道[2]。 1995 年我国首次有关于PRRS 的描述，1996 年郭宝清等分离确定了引起该疫病流行的病原-PRRSV（CH-1a 株），随后世界各地呈大面积流行， 给养猪业造成了巨大的经济损失[3]。 根据该病在我国的流行特点和临床表现，可分为3 个流行趋势。 1995-2004 年以经典PRRS 为主，主要表现为母猪流产和仔猪呼吸道症状，代表毒株分别为CH-1a 株、BJ-4 株[4]；2005-2014 年以高致病性PRRS 为主，主要表现为高热、高发病率和高病死率，代表毒株分别为JXA1 株、HuN4 株和TJM 株[5]；2015-2019 年多种毒株并存，NADC30-like 毒株普遍流行，其基因组核苷酸同源性低，重组频繁，母猪以流产为主，各阶段猪只以呼吸道症状为主[6]。PRRS临床变化呈多样性， 给该病的临床诊断带来很大困难。 目前运用RT-PCR 技术和基因测序等分子生物学技术，是鉴别PRRSV 分离株最为有效的手段。

根据经典PRRSV、 高致病性PRRSV （HPPRRSV） 及NADC30-like 株Nsp2 基因上存在不同数量核苷酸的缺失， 在缺失区域两端的保守区设计通用引物 （见图1）， 建立了一种快速准确灵敏的RT-PCR 检测方法[7]。该方法不仅可以有效节约时间和成本，还为PRRS 的早期诊断、流行病学调查及免疫防控提供科学依据。

图1 引物设计原理模式

1 材料与方法

1.1 病毒株 猪繁殖与呼吸综合症病毒 （CH-1R株）、NADC-30like 株质粒、猪瘟病毒（HCV）、猪圆环病毒（PCV-2）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）及猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）均由兆丰华生物科技（福州）有限公司提供，高致病性疫苗株购自广东大华农动物保健品股份有限公司。

1.2 主要试剂 RNA viral kit 购自Omega 公司；AMV 反转录酶、Random primer、DL2000 DNA marker 和dNTPs(2.5 mmol/L)均购自宝生物工程（大连）有限公司；PCR Master Mix(2×)购自天根生化科技有限公司。

1.3 Nsp2 基因引物设计与合成 参照GenBank 中登录的 PRRSV、HP -PRRSV 及 NADC30 -like PRRSV Nsp2 基因序列， 通过Primer Premier 5.0 和Oligo 7.0 软件在其保守区设计引物。Nsp2 基因引物序列为，F：5'-TTTGATTGGRATGTTGTGCT-3'；R：5'-TGAGTAYTTTGGGCGTGTGAT-3'。 扩增的目的片段大小分别为1 000 bp、900 bp 和700 bp。 引物均由上海生物工程有限公司合成。

1.4 病毒RNA 的提取和cDNA 的合成 使用RNA viral kit 试剂盒提取总RNA， 具体操作按说明书进行。 利用AMV 反转录酶将RNA 反转录成cDNA，具体操作参照说明书进行，-20 ℃保存备用。

1.5 PRRSV Nsp2 基因扩增与测序 以提取的样品cDNA 为模板， 用所设计的引物进行PCR 扩增，反应体系(50 μL)：2×PCR Master Mix 25 μL、上下游引物(20 μmol/mL)各2.5 μL、cDNA 2 μL，补充去离子水至终体积为50 μL。 PCR 反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性50 s，55.5 ℃退火45 s，72 ℃延伸50 s，35 个循环；72 ℃延伸10 min。 反应结束后，加样品3 μL 用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。 对有目的条带的扩增产物送上海生物工程技术有限公司进行序列测定。

1.6 引物特异性试验 分别以圆环病毒、伪狂犬病病毒的DNA 和猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒的cDNA 为模板进行PCR 扩增，用以验证引物的特异性。

1.7 临床应用 用建立的RT-PCR 方法对临床样品进行检测，并设立阴性对照。

2 结果与分析

2.1 PRRSV 不同毒株的PCR 扩增 通过RTPCR 方法对经典PRRSV 疫苗株扩增出一条大小为1 000 bp 的目的片段，高致病性PRRSV 疫苗株扩增出一条大小为900 bp 的目的片段，对NADC30-like株扩增出一条大小为700 bp 的目的片段，与预期目的片段一致且差异明显（见图2）。 将目的条带进行纯化、克隆、测序，经Blast 比对分析，与GenBank 中的PRRSV Nsp2 序列相似度高达99%以上。

图2 RT-PCR 扩增结果

2.2 特异性试验 对经典PRRSV 疫苗株、 高致病性PRRSV 疫苗株、NADC30-like 株、猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒进行RNA 提取与cDNA 合成， 对圆环病毒和伪狂犬病病毒进行DNA 提取， 以上述cDNA 和DNA 按照上述的PCR反应体系和条件进行扩增。 琼脂糖凝胶电泳结果见图3，设计的引物仅可从PRRSV 不同毒株中扩增出相应目的条带，其它均无特异性扩增条带，提示该方法具有良好的特异性。

图3 琼脂糖凝胶电泳结果

2.3 临床应用 用建立的RT-PCR 检测方法对58 份疑似PRRSV 感染猪的肺脏、 脾脏和淋巴结等进行总RNA 提取， 并对其反转录成cDNA 进行扩增，经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示34 份为阳性（阳性率58.62%）。 其中经典PRRSV 3 份（占8.82%），HP-PRRSV14 份 （占41.18%），NADC30-like 检出5 份 （占14.71%）， 经典PRRSV 与HPPRRSV 共 感 染3 份，NADC30-like 与HP-PRRSV共感染9 份，多毒株共感染计12 份（占35.29%），提示HP-PRRSV 仍占主导，但多毒株共感染成为流行趋势。HP-PRRSV 还可以细分为JXA1 株、TJM 株和HuN4 等，所以，总体数量大于其他类别的毒株。

3 结 论

目前PRRSV 的鉴定方法主要包括血清学试验和分子生物学试验。血清学试验如免疫荧光、酶联免疫吸附、中和反应、免疫组化等主要用于抗体检测，通常不能区分抗体是来自经典毒株、 高致病性毒株还是NADC30-like 毒株的感染。 分子生物学试验包括常规PCR、原位杂交、环介导等温扩增技术、荧光定量PCR 等， 该类方法灵敏度高、 特异性强、耗时短。目前分子生物学技术发展迅速，Spear A 等[8]针对PRRSV Nsp9 序列建立同时可以检测出2 种PRRSV 的实时荧光定量PCR 检测方法。 张杰等[9]根据PRRSV ORF7 基因序列设计引物，建立了检测该病毒的SYBRGreen I 染料荧光定量PCR 方法。项明源等[10]根据NADC30-like 毒株Nsp2 基因保守序列设计特异性引物， 建立了PRRSV NADC30-Like 毒株荧光定量PCR 检测方法。

上述检测方法均具有灵敏度高、准确、快捷的特点，但荧光定量PCR 最大的不足就是设备和试剂昂贵， 且目前研究的方法只能针对某一类PRRSV，不能一次有效地区分多种毒株。 近年来，NADC30-like成普遍流行毒株， 通过对比发现其基因组与PRRSV、HP-PRRSV 差异很大，这对于PRRS 的诊断检测带来新的挑战。 而本研究是基于经典PRRSV、HP-PRRSV 及NADC30-like PRRSV 的Nsp2 基 因上存在不同数量核苷酸的缺失，通过RT-PCR 技术对PRRS 病毒分离株进行鉴别，该方法操作简单、成本低廉、 用时少， 可以快速检测并鉴别出不同的PRRSV 毒株，为PRRS 流行病学调查及免疫防控提供科学依据。 利用该方法对圆环病毒、 伪狂犬病病毒、猪瘟病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒等猪源性病毒进行检测，结果均为阴性，说明该方法具有良好的特异性。

临床检测结果发现， 大部分患猪存在多种PRRSV 毒株感染的情况， 共感染呈广泛流行性，且NADC30-like 有增多的趋势。 这与国内大部分地区的研究一致，如王艳午等[11]于2016-2017 年在广东地区分离的PRRSV 以高致病性毒株为主， 并且开始出现NADC30-like 毒株，呈现多毒株共感染。 林志锋等[12]从福建某猪场采集9 份疑似感染PRRSV的猪病料进行病毒分离及分离毒株ORF5、ORF7 基因扩增， 结果显示2 株为PRRSV 与HP-PRRSV 的重组毒株，5 株属于NADC30-like PRRSV。

目前由于非洲猪瘟疫情的影响， 养猪业各类疫苗（包括PRRS 疫苗）的使用大幅减少，随着国家大力支持复养，生猪数量可能快速增加，PRRS 也许将出现又一轮的流行， 养殖场应根据监测数据及临床使用效果给予合理的免疫接种。 由病毒学基础理论可知，PRRS 疫苗对新病毒也会有交叉免疫保护作用。 因此，我国养猪场做好PRRS 疫苗免疫，并加强环境和生物安全管理，不仅可及早控制和清除病毒，也为病毒的重组减少了机会。