MG63细胞对载辛伐他汀纳米胶束摄取的高效液相色谱法测定*

牛 茂，冯先玲，许有诚

MG63细胞对载辛伐他汀纳米胶束摄取的高效液相色谱法测定*

牛 茂1，冯先玲2，许有诚1

（1. 深圳职业技术学院 医学技术与护理学院，广东 深圳 518055；2. 深圳大学 医学部，广东 深圳 518060）

本实验旨在应用高效液相色谱（HPLC）法定量检测人成骨样细胞—MG63细胞对载辛伐他汀纳米胶束（SVNs）的摄取情况．首先，建立检测SVNs中SV含量的HPLC法，确定色谱条件，并对该方法的专属性与准确性进行评价．其次，将SVNs与辛伐他汀（SV）干预细胞，在加药后的不同时间终止实验，反复冻融破碎细胞，提取胞内药物并用HPLC法对其进行检测．结果显示，当流动相比例为30：70（V/V）时，定量检测SVNs中SV含量的标准曲线拟合方程为=33782-1424.5（2=0.9999），线性范围为0.2~3.2 µg/mL．该方法专属性与准确性均较高，并成功检测出了被MG63细胞摄取到胞内的药物含量．同时，在加药早期，SVNs与SV相比，SVNs被MG63细胞摄取的速度较慢，但胞内药物含量显著高于SV，SVNs与SV被MG63细胞摄取存在显著差异．

辛伐他汀；纳米胶束；高效液相色谱法；成骨细胞；细胞摄取

辛伐他汀（simvastatin，SV）可促进骨缺损区域新骨形成[1]，在增加口腔种植修复患者颌骨骨量及缩短口腔种植体与颌骨发生骨结合时间方面有较大的应用前景．但SV作为脂溶性药物，难溶于水，骨生物利用度极低，且大量使用时存在潜在的副作用[2,3]，从而严重限制了其在颌骨成骨领域的应用．本课题组在前期通过应用纳米胶束包载SV，将其改造为载辛伐他汀纳米胶束（simvastatin-loaded nanomicelles，SVNs）后，显著提高了SV的体内、外成骨生物学效能[4,5]，但关于SVNs显著提高SV促成骨效能的机制目前知之较少．

细胞对药物摄取的方式对药效发挥具有重要的影响．脂溶性的小分子药物如SV大多以被动扩散的方式，沿着药物浓度梯度进入细胞．而载药纳米胶束如SVNs呈水溶性，主要以网格蛋白依赖的内吞作用进入细胞[6-8]．因此，SVNs和SV被成骨细胞以不同方式摄取是SVNs显著提高SV促成骨效能的可能机制之一．

目前，载药纳米胶束的细胞摄取情况常采用荧光探针代替药物进行间接、定性或半定量的研究[9-11]．这种方法常选择荧光探针—6-香豆素作为如SV等脂溶性药物的模型，然后，用纳米胶束包载荧光探针，在激光共聚焦显微镜（confocal laser scanning microscopy，CLSM）或流式细胞仪（Flow cytometer）下观察不同时相细胞内的荧光强度，并用软件对荧光强度进行计算，进而对该种纳米药物的摄取情况进行定性或半定量评价．这种采用荧光探针代替实际药物对合成的纳米药物细胞摄取情况测定的方法是否真实可靠是值得商榷的．

高效液相色谱（high-performance Liquid chromatography，HPLC）法凭借其高精度、高灵敏度特性可实现对细胞内药物直接进行定量研究．本研究应用HPLC法实现了对MG63细胞摄取入细胞内的SVNs中SV含量进行定量检测，为后续进一步研究SVNs被成骨细胞摄取的方式及机制打下基础．

1 材料与方法

1.1 SVNs的合成及表征

本实验中使用的SVNs由课题组前期应用透析法合成[5]．纳米胶束材料为甲氧基聚乙二醇-聚乳酸二嵌段共聚物（methoxy polyethy-lene glycoL-Polylactic acid，mPEG-PLA）（Mn=5000- 3000）．合成的SVNs外型呈球形，粒径为（26.62±6.02）nm．

1.2 高效液相色谱法检测SVNs中SV含量的方法建立

1.2.1 色谱条件

高效液相色谱仪为岛津-20AD HPLC系统；色谱柱为KromasiL C18（250×4.6 mm）；通过参阅文献，分别选择0.1%磷酸水溶液（色谱纯）和乙腈溶液（色谱纯）作为流动相A（水相）和流动相B（有机相），两者比例为35:65和30:70（V/V），通过后续实验择优选择；进样量为10 µL；流速为1 mL/min；检测波长为238 nm；柱温为30 ℃．

1.2.2 绘制SV标准曲线

用适量乙腈溶解SV标准品配制成浓度为200µg/mL的SV溶液．首先，分别在流动相比例为35:65和30:70（V/V）时，进样200 µg/mL SV溶液10 µL，确定SV主成分峰的保留时间．其次，分别吸取10、20、40、80 和160 µL溶液用乙腈稀释到10 mL，制成0.2、0.4、0.8、1.6和3.2 µg/mL系列梯度浓度SV溶液，在上述色谱条件下绘制SV的标准曲线．

1.2.3 确定方法专属性

分别取SV溶液、SVNs溶液、空白纳米粒溶液和空白溶液（乙腈溶液）分别进样10 µL，得色谱图后观察空白纳米粒溶液和空白溶液是否会干扰SV和SVNs的检测，以确定其方法专属性的优劣．

1.2.4 方法的精密度和回收率

选取0.2、0.8和3.2 µg/mL3个浓度连续3 d测定上述方法的回收率，进而测定该方法的日内和日间精密度．

1.3 MG63细胞对SVNs摄取的HPLC法定量检测

本实验分为两组，包括实验组—载SV纳米胶束组（simvastatin-loaded nanomicelle group，SVNG）和对照组—SV组（free simvastatin group，SVG）．

将MG63细胞按5×105/孔接种于6孔板上，每孔加完全培养基2 mL，在37 ℃和5%CO2的细胞培养箱中培养24 h后吸除完全培养基，用预热至37 ℃的PBS溶液润洗3次，每孔加入2 mL无血清培养基在培养箱中孵育60 min，按实验分组加入已预热到37 ℃的相应药物（药物用无血清培养基配制），SVNG和SVG中SV的浓度为2 µg/mL，分别在5、10、15、30、60、120、180和240 min终止实验，倾去药物并用预冷的PBS溶液快速润洗4次后置于-80 ℃冰箱，反复冻融细胞3次使MG63细胞破裂释放出摄入胞内的SVNs和SV，每孔加入1 mL乙腈溶液提取SV，超声3 min，10000 r/min离心5 min，取上清液，0.22 µm针孔滤膜过滤入进样瓶，采用HPLC法定量测定SVNs和SV的摄入量．

2 结果与讨论

2.1 SVNs中SV含量进行定量检测

用HPLC法对SV进行检测时常采用梯度洗脱和等度洗脱方式．一般梯度洗脱用于复杂试样的检测分析，操作较繁琐[12]．本实验使用的SV标准品纯度在99%以上，更适用于等度洗脱方式对其进行检测．在采用HPLC法检测SV时，流动相A与B的比例是需要根据实验条件进行调整的，两者的比例一般在30:60-10:90之间[13-15]．

本实验将流动相A与B的比例设定为35:65和30:70．实验结果显示，当流动相A与流动相B的比例为35:65时，SV主成分峰的保留时间为21.603 min（图1A），在0.2~3.2 µg/mL范围内所得标准曲线的拟合方程为：=32666-2054（2=0.9996），线性关系良好．但在1.6 µg/mL和3.2 µg/mL处样品主成分峰与周围杂峰没有完全分开（表1），不满足药典[16]关于分离度要大于1.5的要求．

而当流动相A与流动相B的比例为30:70时，SV主成分峰的保留时间为15.811 min（图1B），在0.2~3.2 µg/mL范围内所得标准曲线的拟合方程为：=33782-1424.5（2=0.9999），线性关系关系良好，所有浓度样品主成分峰分离度良好（表1），满足药典[16]要求．

图1 SV标准品主成分峰保留时间

进一步对0.2、0.8和3.2 µg/mL 3个浓度SV溶液评价回收率测定结果显示，该方法的平均回收率、日间及日内精密度均较高（表2）．

表1 系列梯度浓度SV溶液HPLC法测定结果

表2 SV溶液平均回收率

此外，采用上述色谱条件对SVNs和SV进行分析时，空白纳米胶束溶液和空白溶液均未对样品主成分峰造成干扰，说明应用上述HPLC法分析SV的专属性良好（图2）．因此，后续实验应用HPLC法检测MG63细胞摄取入胞内的SVNs中SV含量时，选择流动相A与B的比例为30:70，其他色谱条件不变．

2.2 MG63细胞对SVNs和SV的摄取对比

MG63细胞对SVNs和SV的摄取情况见图3．结果显示，在SVG中，MG63细胞对SV的摄入十分迅速，15 min时胞内药物浓度即达到最高峰．而MG63细胞对SVNs的摄入速度较慢，从30 min开始，MG63对载药胶束的摄入量才开始逐渐增多．SVNs被成骨细胞摄取速度较慢的原因可能与其粒径过小及表面未带电荷有关系．已有研究显示，载药纳米胶束的粒径、表面所带电荷情况等都可影响细胞对载药纳米胶束的摄取．有学者[17]报道载药纳米胶束的粒径在约50 nm时，其被细胞摄取的效率是最高的；而当纳米表面带正电荷时，可增加载药纳米胶束与细胞膜的吸附能力，从而增加其被细胞摄取的效率[18]．在今后的实验中，通过控制SVNs的粒径，并对其表面进行修饰，可增加其被细胞摄取的效率，从而发挥出更强的促细胞成骨分化作用．

图2 HPLC法测定SV的专属性色谱图

图3 MG63细胞对SVNs与SV在不同时间点的摄取情况（n=6; *P<0.05; **P<0.01）

同时，SVG中的胞内SV含量在达到高峰后随即迅速下降，这种现象在多形核白细胞摄取亚胺培南[19]、人牙周膜成纤维细胞摄取甲硝唑和替硝唑[20]及红细胞摄取抗癌铂的配合物[21]等实验中均有出现．其可能的原因是，SV以被动扩散的方式进入胞内后容易被水解代谢，导致含量下降；也可能是药物与细胞膜相互作用使膜通透性发生改变，导致药物漏出细胞外；此外，细胞膜上的外排蛋白是否也有参与，有待后续实验加以验证．

此外，在相同时间点，MG63细胞对SV和SVNs的摄取量除了在60 min时没有显著差异（＞0.05）外，在其他时间均存在显著差异（＜0.05），其中，在加药60 min后，MG63细胞对SVNs的摄取量显著高于SV．由此可见，应用纳米胶束包载SV改变其剂型后，可显著提高细胞内SV的药物浓度和存留时间，SVNs表现出较SV更强的成骨效能可能与此密切有关．

4 结 论

应用HPLC法对MG63细胞摄取的SVNs中SV含量的直接定量检测，并通过对比发现，加药早期SVNs被细胞摄取的速度较SV慢，但SVNs可显著提高SV在胞内的浓度和作用时间，提示SVNs与SV被细胞摄取存在不同的方式，这可能是SVNs显著提高SV促成骨效能的机制之一．

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Analysis the Uptake of Simvastatin-Loaded Nanomicelles in MG63 Cells by HPLC

NIU Mao1, FENG Xianling2, XU Youcheng1

（）

This experiment aims to quantitatively detect the uptake of simvastatin-loaded nanomicelles (SVNs) in human osteoblast-like cells (MG63 cells) by HPLC. First, the HPLC conditions for detecting simvastatin (SV) contained in SVNs were determined. And the specificity and accuracy of the method were evaluated. Secondly, the MG63 cells were incubated with SVNs and SV. The experiment was terminated at different times, and the cells were broken by frozen-thawed. The intracellular SV content were extracted and measured by using HPLC method. The results show that when the mobile phase ratio was 30:70 (V/V), the standard curve fitting equation for quantitative detection of SV contained in SVNs is=33782-1424.5 (2=0.9999), and the linear range was 0.2-3.2µg/mL. The specificity and accuracy of this HPLC method were higher, and the SV content in MG63 cells was successfully detected. At the same time, in the early stages of dosing, SVNs were taken up by MG63 cells more slowly than SV, but the intracellular drug content of SVNs was significantly higher than SV. There is a significant difference in the uptake of SVNs and SV by MG63 cells.

simvastatin; nanomicelles; high-performance liquid chromatography method; osteoblast; cellular uptake

2020-05-08

广东省教育厅普通高校特色创新类项目资助（2018GKTSCX028）、广东省医学基金资助项目（A2018170）

牛茂，男，山西人，博士，副教授，研究方向：纳米药物在口腔医学中的应用．

R96

A

1672-0318（2020）05-0036-05