CHI3L1对软脂酸处理后人脐静脉内皮细胞氧化应激的影响

王巧，邹舒玥，常帅，周佳

南华大学附属第一医院超声影像科，湖南衡阳 421000

动脉粥样硬化主要是一种大、中型动脉疾病，具有内皮功能障碍、血管炎症、脂质及胆固醇代谢异常等病理特征，其机制包括氧化应激学说、炎症学说、损伤反应学说、脂质浸润学说等[1]。其中氧化应激学说认为外源性和内源性的过氧化物质增多及抗氧化能力减弱时，易产生多种有害物质妨碍蛋白质分子的正常翻译，造成蛋白质无法保持应有的折叠结构而失活；过多的未折叠蛋白质在内质网内沉积，启动内质网应激，而当内质网无法处理这些蛋白时，即促使内皮细胞进入凋亡途径[2]。而炎症反应学说认为动脉粥样硬化的形成是血浆蛋白、动脉壁的细胞以及各种细胞成分相互作用的慢性炎症过程[3]。上述各种学说之间并非孤立存在，但血管内皮细胞损伤是动脉粥样硬化发生的起始环节。因此，研究药物拮抗氧化应激或炎症反应损伤对防治心血管疾病具有重要意义。壳多糖酶3样蛋白1(Chitinase-3-like protein 1，CHI3L1)又称YKL-40、HC-gp39及乳腺回归蛋白39，是哺乳动物几丁质酶保守家族的18种糖基水解酶之一。循环中的CHI3L1是一种肌动蛋白，运动后在骨骼肌中被诱导表达，从而刺激心肌细胞增殖[4]。CHI3L1也是多种细胞的生长因子，在细胞外基质重塑及血管生成中起重要作用。有证据表明，在心血管炎症的发生发展过程中，CHI3L1可能与动脉粥样硬化的发病有关[5-6]。但对不同的细胞类型及在不同的实验条件下，CHI3L1可能发挥促炎及抗炎双重活性[4,7]。目前，CHI3L1对炎症的影响存在争议，尚未明确CHI3L1是否直接影响内皮功能失调从而影响动脉粥样硬化。因此，本研究使用软脂酸诱导内皮细胞功能失调，观察CHI3L1预处理后是否影响内皮细胞的促炎细胞因子释放及细胞内氧化应激水平，旨在为探索CHI3L1的生物学功能提供依据。

1 材料与方法

1.1主要实验材料 人脐静脉内皮细胞(HUVECs)购自美国菌种保藏中心(ATCC)。重组CHI3L1购自美国Abcam公司。噻唑蓝(MTT)、血红素、锡原卟啉(SnPP)及软脂酸均购自美国Sigma-Aldrich公司。抗人抗核纤层蛋白B(Lamin B)、血红素氧合酶(HMOX)、还原型辅酶Ⅰ/Ⅱ依赖醌氧化还原酶1(NQO1)、肌动蛋白(Actin)、重链结合蛋白(BIP)、蛋白质二硫键异构酶(PDI)、伴侣蛋白/葡萄糖调节蛋白(BIP1/GRP)78、内质网氧化还原1样蛋白(Ero1-Lα)、钙连蛋白(Calnexin)、内质网核信号转导蛋白-1α(IRE-1α)及磷酸化的真核细胞翻译起始因子2α(p-eIF2α)多克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司。抗p65、抗核因子E2相关因子2(Nrf2)多克隆抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)及总蛋白激酶B(total-Akt)单克隆抗体均购自美国Cell Signaling公司。

1.2细胞培养 HUVECs用含100 U/μl青霉素、100 U/μl链霉素及10%胎牛血清的F-12K培养基培养。培养条件为37 ℃、5% CO2及95%湿度，2 d左右换培养基。传代时先用EDTA-胰蛋白酶(含0.02% EDTA及0.05%胰蛋白酶)分离细胞，第3～7代的细胞用于后续实验。在研究不同浓度CHI3L1对HUVECs活性的影响时，将细胞用10、30、50、100及150 ng/ml CHI3L1处理24 h，采用MTT法检测细胞活力，用来确定下一步实验的使用浓度。在每孔细胞(1×105个/ml)中加入10 μl MTT溶液(5 mg/ml)，继续培养4 h，加150 μl二甲基亚砜(DMSO)后振荡10 min，使结晶物充分溶解，然后将其加入6孔板，测定570 nm波长下的光密度(OD)值，计算得到细胞活性。将实验分为对照组、软脂酸组及CHI3L1+软脂酸组。对照组未使用任何药物处理；软脂酸组用100 μmol/L的软脂酸处理24 h；CHI3L1+软脂酸组先用100 ng/ml的CHI3L1预处理细胞2 h，再加入100 μmol/L的软脂酸处理24 h。

1.3Western blotting检测细胞核及细胞质中p65、细胞核中Lamin B、Actin、HMOX、NQO1、p-Akt、Ero1-Lα、Calnexin、PDI、BIP1/GRP78、IRE-1α及p-eIF2α含量 收集细胞后用低渗缓冲液进行重悬浮，随后用裂解缓冲液A重悬浮并于冰上静置 1 min。4 ℃条件下以13 000 r/min离心10 min后，上清液为细胞总蛋白。向沉淀中加入裂解液B，4 ℃条件下漩涡震荡30 min后，以13 000 r/min离心5 min，得到上清核蛋白。取35 μg蛋白进行SDSPAGE电泳，利用电转法将其转至硝酸纤维素膜，封闭，加入相应一抗后置入4 ℃冰箱孵育过夜，将膜洗净后加入HPR标记的二抗，室温反应30 min。最后用化学发光法进行显影。

1.4ELISA法检测各组HUVECs细胞上清液中的白细胞介素(IL)-6及肿瘤坏死因子(TNF)-α含量 实验按照试剂盒说明书步骤进行操作。以空白孔调零，反应终止后于450 nm波长处测定OD450值，然后根据标准曲线方程计算IL-6及TNF-α的表达水平。

1.5NF-κB结合DNA的活性测定 将处理好的细胞核提取物添加到预先包被了NF-κB p65 DNA识别位点的96孔板，然后用PBS缓冲液洗涤，随后添加核因子(NF)-κB抗体在室温中孵育1 h。再孵育HRP标记的二抗并加入显色底物进行显色，随后测定OD450的值。

1.6免疫荧光检测Nrf2核转位 收集处理后的细胞，4%多聚甲醛固定，用0.2%Triton X-100在室温条件下处理10 min，然后封闭，加入Nrf2一抗，在4 ℃条件下孵育过夜。洗膜后再加入二抗，然后采用DAPI染细胞核，置于荧光显微镜下观察Nrf2在HUVECs中的分布情况。

1.7统计学处理 采用SPSS 17.0软件进行统计分析。所有数据以±s表示，多组间比较采用方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1CHI3L1对HUVECs活性的影响 用10、30、50及100 ng/ml CHI3L1处理24 h后HUVECs细胞活性无明显降低；而用150 ng/ml CHI3L1处理后，HUVECs细胞活性降低至对照组的88%(P＜0.05，图1)，故在后续研究中将CHI3L1的使用浓度设定为100 ng/ml。

图1 不同浓度CHI3L1对HUVECs活性的影响Fig. 1 Effect of different concentrations of CHI3L1 on HUVECs activity

2.2CHI3L1对软脂酸激活NF-κB的影响 Western blotting结果显示，软脂酸组细胞核中NF-κB的p65亚基含量明显高于对照组，细胞质中p65含量明显低于对照组，CHI3L1+软脂酸组细胞核中p65水平明显低于软脂酸组，细胞质中p65的含量明显高于软脂酸组，差异均有统计学意义(P＜0.05，图2、表1)。 DNA结合活性实验结果也显示，CHI3L1+软脂酸组p65 DNA结合活性低于软脂酸组，差异有统计学意义(P＜0.05，图2、表1)。

图2 CHI3L1对软脂酸激活NF-κB的影响(Western bloはing)Fig. 2 Effect of CHI3L1 on NF-κB activized by palmitic acid (Western blotting)

表1 CHI3L1对软脂酸激活NF-κB的影响(±s, n=3)Tab. 1 Effect of CHI3L1 on NF-κB activized by palmitic acid (±s, n=3)

表1 CHI3L1对软脂酸激活NF-κB的影响(±s, n=3)Tab. 1 Effect of CHI3L1 on NF-κB activized by palmitic acid (±s, n=3)

与对照组比较，(1)P＜0.05；与软脂酸组比较，(2)P＜0.05。

2.3CHI3L1对软脂酸诱导HUVECs释放IL-6、TNF-α的影响 ELISA检测结果显示，对照组上清中促炎因子IFN-α及IL-6水平[分别为(12.3±4.5) pg/ml 及(9.25±6.2) pg/ml]CHI3L1+软脂酸组上清中促炎因子TNF-α及IL-6水平[分别为(85.91±21.16) pg/ml及(71.43±10.56) pg/ml]，均低于软脂酸组[分别为(221.12±18.71) pg/ml及(95.03±11.20) pg/ml]，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.4CHI3L1对HUVECs内HMOX及NQO1表达的影响 Western blotting结果显示，软脂酸组的HMOX及NQO1相对表达量分别为0.32±0.09及0.62±0.09，CHI3L1+软脂酸组中的HMOX及NQO1相对表达量分别为0.58±0.07及1.08±0.04，均明显高于对照组(分别为0.18±0.12及0.51±0.10)，且CHI3L1+软脂酸组明显高于软脂酸组，差异有统计学意义(P＜0.05，图3)。

图3 CHI3L1诱导HUVECs表达HMOX及NQO1(Western blotting)Fig. 3 CHI3L1 induces the expression of HMOX and NQO1 in HUVECs (Western blotting)

图4 CHI3L1诱导HUVECs Nrf2核转位(免疫荧光)Fig. 4 Nuclear translocation of HUVECs Nrf2 induced by CHI3L1 (Immunofluorescence)

2.5CHI3L1诱导HUVECs Nrf2核转位 免疫荧光检测结果显示，对照组HUVECs细胞中的Nrf2主要位于细胞质内，软脂酸组细胞核中Nrf2轻微增多，而CHI3L1+软脂酸组细胞核中的Nrf2含量较软脂酸组明显增多(78.64%±3.16% vs. 10.26%±4.53%，P＜0.05，图4)。

2.6CHI3L1对PI3K/Akt磷酸化水平的影响 Western blotting检测结果显示，对照组的PI3K/Akt通路中的p-Akt水平较低(0.08±0.01)，软脂酸组有一定增加(0.15±0.09)，CHI3L1+软脂酸组(0.51±0.04)明显高于软脂酸组及对照组，差异均有统计学意义(P＜0.05，图5)。

2.7CHI3L1对软脂酸处理后内质网应激相关分子表达的影响 Western blotting结果显示，软脂酸组的Ero1-Lα、Calnexin、PDI、BIP1/GRP78、IRE-1α及p-eIF2α等内质网应激相关分子的表达水平高于对照组，CHI3L1+软脂酸组中这些分子的表达量低于软脂酸组，差异均有统计学意义(P＜0.05，图6，表2)。

图5 CHI3L1上调PI3K/Akt的磷酸化水平(Western blotting)Fig. 5 Up-regulation of PI3K/Akt phosphorylation by CHI3L1 (Western blotting)

3 讨 论

图6 各组内质网应激相关分子表达情况比较(Western blotting)Fig. 6 Expressions of stress-related molecules in endoplasmic reticulum of each group (Western blotting)

表2 CHI3L1对软脂酸处理后内质网应激相关分子相对表达量的影响(±s, n=3)Tab. 2 Effect of CHI3L1 on relative expression levels of endoplasmic reticulum stress related molecules after palmitic acid treatment (±s, n=3)

表2 CHI3L1对软脂酸处理后内质网应激相关分子相对表达量的影响(±s, n=3)Tab. 2 Effect of CHI3L1 on relative expression levels of endoplasmic reticulum stress related molecules after palmitic acid treatment (±s, n=3)

与对照组比较，(1)P＜0.05；与软脂酸组比较，(2)P＜0.05。

尽管运动与心血管疾病之间的联系仍不清楚，但缺乏运动与心血管事件的发生存在一定关联。骨骼肌可能分泌某些肌源性蛋白，从而降低心血管疾病的发生风险，但目前对于其在动脉粥样硬化进展中的作用仍不明确。卵泡抑素相关蛋白1(FSTL1)是肌动蛋白之一，在骨骼肌肥大过程中表达上调。急性冠脉综合征患者的血清FSTL1水平升高，而收缩期心力衰竭患者循环FSTL1水平升高与左室肥厚有关[10]。但也有研究表明，肌动蛋白在心血管系统中具有一定保护作用，如重组成纤维细胞生长因子(FGF)21通过诱导LDL受体(LDL-R)增加肝细胞及巨噬细胞对胆固醇的摄取[11]。FGF通过FGFR1/β-Klotho-PI3K-AKT1-BAD依赖途径减轻心肌缺血再灌注损伤诱导的细胞凋亡。肌源性神经源性神经营养因子(MDNF)可改善心脏收缩功能障碍，减少心肌肥大及凋亡，从而改善心功能[12]。因此，鉴定与动脉粥样硬化反应有关的新型肌动蛋白可能是预防冠状动脉粥样硬化的有效靶点。CHI3L1是近年来发现的一种新的改善骨骼肌胰岛素抵抗及炎症的肌动蛋白，但目前有关CHI3L1对内皮细胞功能影响的相关研究较少。本研究结果证实，CHI3L1对软脂酸所致炎症及氧化应激反应的作用有关，发现CHI3L1处理HUVECs细胞后，其氧化应激相关分子水平明显降低，表明CHI3L1可减轻软脂酸引起的氧化应激反应。

研究证实，自由脂肪酸可活化HUVECs的NF-κB， 从而促进生成活性氧(reactive oxygen species，ROS)及促炎细胞因子[13]。软脂酸是自由脂肪酸的一种，能够被TLR4识别，可激活内皮细胞等不同类型细胞中的NF-κB，从而释放多种炎性因子，并促进大量ROS生成[8,14]。本研究还发现，软脂酸能导致HUVECs细胞质中的p65表达下调，细胞核中的p65表达上调，且与DNA的结合能力也有所增加，证实软脂酸能够活化NF-κB。但用CHI3L1干预后，发现NF-κB的活力明显下降。此外，CHI3L1处理也能降低软脂酸处理后TNF-α及IL-6的释放，表明CHI3L1可通过抑制NF-κB的活性而降低炎症反应的强度。

为探讨CHI3L1是否能影响内皮细胞的氧化应激水平，本研究随后测定了细胞内抗氧化应激分子NQO1及HMOX蛋白的表达水平，结果表明，CHI3L1处理可明显提高NQO1及HMOX蛋白的表达量。NQO1及HMOX蛋白是能被诱导表达的具有抗氧化功能的酶类物质，在机体内具有抑制炎症、免疫调节、抗氧化应激、调控细胞增殖及凋亡等多种功能，从而抵抗动脉粥样硬化并保护心血管系统。载脂蛋白E缺陷小鼠中的HMOX基因缺失后能够加重血管炎症，促进动脉粥样硬化的发展，转染HMOX基因则能够降低动脉粥样硬化的病变程度[15]。研究证实，NQO1及HMOX受到核转录因子Nrf2的调控[16]，本研究也证实，CHI3L1可诱导Nrf2发生核转位，说明CHI3L1上调NQO1及HMOX表达是通过影响Nrf2的核转位而实现的。此外，CHI3L1还可诱导PI3K/Akt磷酸化，PI3K/Akt发生磷酸化是细胞增殖的重要信号途径，CHI3L1可能通过活化PI3K/Akt而拮抗软脂酸所致的细胞凋亡[17-18]。

近年来，内质网功能失调在动脉粥样硬化中的作用日益受到重视。内质网本质上是一种动态管状网络结构，其参与了蛋白质折叠等多种生物学功能[19]。内质网功能发生障碍是引起β细胞失去活性的主要因素，也是导致糖尿病患者肝脏、脂肪组织及心血管系统发生损伤的重要原因[20-22]。本研究结果表明，软脂酸处理可明显增加PDI、BIP、Ero1-Lα、IRE-1α、Calnexin及p-eIF2α的表达水平，但经CHI3L1处理后这些内质网应激相关分子的表达量明显降低，证实CHI3L1能够明显改善由软脂酸所致的氧化应激，进而起到保护内皮细胞的作用。

综上所述，CHI3L1预处理能够导致HUVECs依赖性表达HMOX及NQO1分子。抑制NF-κB的活性可降低软脂酸引起的炎症反应，表明CHI3L1对软脂酸引起的内皮功能障碍起保护功能，因此推测在糖尿病、肥胖及其他代谢性炎症疾病所致软脂酸异常增高的情况下，CHI3L1可通过保护内皮细胞从而延缓动脉粥样硬化的发生及发展。