HK2通过Wnt/β-catenin信号通路上调Cyclin D1、MMP7和Slug表达促进宫颈癌细胞增殖和迁移

冯倩，刘宪，张妮，崔南

0 引言

宫颈癌是一种严重威胁女性健康和生命的生殖系统恶性肿瘤之一。在全球范围内，宫颈癌是次于乳腺癌和结直肠癌的女性第四种常见的肿瘤类型[1]。己糖激酶2（Hexokinase 2,HK2）是己糖激酶（Hexokinase,HK）同工酶的一种，是糖酵解途径中的一个关键酶，低氧状态、葡萄糖、胰岛素等因素均可上调HK2在肿瘤细胞中的表达，目前的研究发现HK2在胶质瘤、胃癌、结直肠癌等肿瘤中高表达，其表达水平与肿瘤的恶性程度密切相关[2]。HK2与线粒体外膜结合后，通过促进异常糖酵解，可以抑制细胞凋亡从而促进肿瘤细胞增殖[3]。但HK2通过Wnt/β-catenin信号转导通路调节宫颈癌细胞生物学行为的研究仍不多见。因此，本研究通过观察HK2对宫颈癌HeLa细胞增殖、细胞活力、细胞周期、迁移和侵袭等生物学行为的影响，探讨HK2通过Wnt/β-catenin信号转导通路中相关蛋白的表达，从而促进宫颈癌细胞增殖和迁移的分子机制，为宫颈癌的治疗探索新的路径。

1 材料与方法

1.1 材料

宫颈癌细胞系HeLa购自美国ATCC。质粒表达载体pCAG-IRES2-AcVEC-neo由本实验室保存。DMEM培养基购自上海源培生物科技有限公司，胎牛血清购自以色列Biological Industries公司，Slug蛋白抗体购自美国Cell Signaling Technology公司，HK2、β-catenin、Cyclin D1、MMP7和GAPDH蛋白抗体均购自美国Santa Cruz公司,Wnt/β-catenin信号通路抑制剂（XAV-939）购自美国Selleck公司，其余试剂为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人宫颈癌细胞HeLa培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于5%CO2的37℃孵箱中进行常规培养。

1.2.2 G418压力筛选稳定表达HK2蛋白的HeLa细胞系 将1×105个细胞接种于6孔板内，待细胞生长至70%～80%融合时，将2 μg重组质粒DNA通过Lipofectamine 2000脂质体转染试剂转染于细胞中。24 h后，将细胞按照1:10比例接种到100 mm培养皿中，加入含有1 000 mg/ml G418的培养基，G418压力筛选3～4周后，挑取细胞单克隆至24孔板中，继续扩增培养。通过Western blot及细胞免疫化学实验，鉴定HK2表达阳性的单克隆细胞。

1.2.3 细胞免疫化学 将对数生长期的细胞常规消化后制备成细胞悬液，接种于0.5 cm×0.5 cm的爬片上，待细胞融合度达到70%左右，PBS液洗涤5 min×3次后，4%多聚甲醛室温固定30 min。PBS液洗涤5 min×3次，加入0.2%TritonX-100，室温放置10 min。PBS洗涤5 min×3次后，将细胞爬片粘在载玻片上滴加一抗，4℃湿盒过夜。次日，取出湿盒，室温放置30 min，PBS洗涤5 min×3次，滴加二抗，室温放置30 min。PBS洗涤5 min×3次后，DAB显色，中性树胶封片，光学显微镜下观察。

1.2.4 细胞计数法检测细胞增殖 将细胞胰酶消化后制备成单细胞悬液，按照4×104个每皿的浓度接种于6孔板里。接种后1、3、5、7 d分别进行细胞计数。根据细胞计数结果绘制细胞生长曲线，每组试验设置3个复孔。实验重复3次。

1.2.5 MTT法检测细胞活性 将细胞胰酶消化后制成单细胞悬液，以1×103个每孔浓度接种于96孔培养板中。于接种后1、3、5、7 d，采用MTT法检测各组OD值。步骤如下：每孔加入20 μl MTT（5 mg/ml），5%CO2培养箱孵育4 h，吸弃上清液，加入100 μl的DMSO，摇床震荡10 min后于酶标仪上测定490 nm波长吸光度值，根据吸光度值绘制生长曲线，各实验组均设置3个复孔，实验重复3次。

1.2.6 细胞周期分析 胰酶消化收集对数生长期细胞，1 000 r/min离心5 min，用预冷的PBS液洗涤细胞2次，加入预冷的70%酒精，4℃冰箱固定细胞12 h。1 000 r/min离心5 min，PBS液洗涤2次。用含0.01% RNase的PI染液100 μl处理细胞，4℃避光染色30 min。使用流式细胞仪进行检测，通过CellQuest软件分析结果。重复实验至少3次。

1.2.7 Western blot实验 收集处于对数生长期的细胞，加入细胞裂解液收集细胞蛋白，并测定各组细胞的蛋白浓度。将蛋白样本与蛋白质分子量标准分别上样于加样孔，进行SDS-PAGE分离蛋白。电泳结束后，进行转膜，转膜结束后，将膜移至含5%的脱脂奶粉的TBST缓冲液中室温封闭1 h，用TBST洗膜10 min×4次。加入一抗，4℃孵育过夜。次日，TBST洗膜10 min×4次，加二抗，室温孵育1 h，TBST洗膜10 min×4次，化学发光检测液进行发光反应，Western blot化学发光成像一体机（陕西鑫来博生物工程有限公司）拍照分析。

1.2.8 细胞划痕实验 将细胞接种于6孔板中生长至90%～95%融合度，用20 μl无菌枪头划一横线，PBS清洗细胞3次，加入无血清的DMEM培养基继续培养24 h，用倒置显微镜进行观察及拍照，选取5个视野进行统计分析。

1.2.9 Transwell体外迁移实验 HeLa细胞饥饿24h后制备成细胞悬液，PBS清洗1遍后，调整细胞浓度为每毫升20×105个。将200 μl细胞悬液加入于Transwell上室，下室中加入600 μl的含10% FBS的DMEM培养基，之后置于含5%CO2的37℃孵箱中进行孵育。24 h后，用棉签擦去上室内残留的细胞，甲醛固定10 min后，用0.1%的结晶紫室温孵育10 min，PBS清洗3遍后，将Transwell小室底面朝上于显微镜下拍照观察，随机选取5～10个视野进行计数，进行统计分析，重复上述实验3次。

1.2.10 Transwell体外侵袭实验 Transwell上室中平铺1:3的Matrigel胶50 μl，紫外灯照射消毒6 h后，将200 μl的细胞悬液加入Transwell上室，下室中加入600 μl的含10% FBS的DMEM培养基，后续步骤同体外迁移实验。

1.2.11 抑制Wnt/β-catenin信号转导通路在HK2过表达HeLa细胞中的活性 Wnt/β-catenin信号通路抑制剂XAV-939按照说明书溶于DMSO，XAV-939工作浓度参考本实验室前期使用浓度，以80 µmol/L为本研究工作浓度开展后续实验[4]。将细胞培养液更换为含XAV-939培养液后，分别于培养1、3、5、7天进行细胞计数和MTT。将Transwell小室内外细胞培养液更换为含XAV-939的DMEM培养液后，进行Transwell体外迁移和侵袭实验，孵育48 h后记录结果；收集经过XAV-939培养液培养的细胞（孵育24 h后），加入细胞裂解液收集细胞蛋白，通过Western blot检测相关蛋白表达。

1.2.12 TOP/FOP萤火虫荧光素酶报告系统实验（TOP/FOP-Flash Luciferase reporter assay） 取对数生长期的各组细胞，0.25%胰酶消化重悬为单细胞悬液，以5×104个/孔细胞浓度接种于24孔板。将TOP/FOP-Flash报告基因质粒与内参载体海参（pRL-TK）报告基因质粒按照LipofectamineTM2000脂质体转染系统说明操作分别共转染于HeLa-VEC和HeLa-Slug细胞。转染48 h 后，按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒操作说明检测荧光素酶活性：弃去24孔板中的培养基，加入PBS，轻轻洗涤细胞后弃去洗涤液，加入100 μl的1×PLB细胞裂解液裂解细胞，将细胞悬液移入1.5 ml EP管，待测。取待测样品20 μl加入EP管中，然后加入100 μl荧光素酶测试试剂LARⅡ吹打混合后，放入发光检测仪中检测萤火虫荧光素酶活性，记录第一次发光值为FLU。加入等体积的1×Stop &GloTM试剂，轻轻混匀，放入发光检测仪中检测Renilla荧光素酶活性，记录第二次发光值为RLU。以FLU/RLU比值评估TOP/FOP-Flash报告基因的相对表达量。

1.3 统计学方法

用SPSS17.0软件进行数据的统计学分析，实验数据结果以均数±标准差（）表示，多组样本间的均数比较采用单因素方差分析，两组样本间的均数比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

图1 HK2对宫颈癌HeLa细胞的影响Figure 1 Effect of HK2 on HeLa cells

2 结果

2.1 HK2促进HeLa细胞的体外增殖和细胞活力

Western blot结果显示，经过G418压力筛选后，成功获得了稳定表达HK2蛋白的HeLa-HK2-5、HeLa-HK2-9及对照细胞HeLa-VEC-1和HeLa-VEC-2细胞系，见图1A。通过绘制细胞生长曲线，发现过表达HK2可以促进HeLa细胞的增殖（P=0.0054），见图1B。MTT法检测结果显示，过表达HK2可以增强HeLa细胞的细胞活力（P=0.0078），见图1C。细胞计数和MTT实验均表明，过表达HK2可以促进宫颈癌细胞HeLa的体外增殖。

流式细胞仪分析结果显示，HeLa细胞中过表达HK2后，HeLa-HK2细胞中处于G0/G1的细胞百分比为（45.46±3.43）%，明显低于HeLa-VEC细胞（57.75±1.03）%（P=0.0092），HeLa-HK2细胞中处于S期的细胞百分比为（38.02±2.31）%，明显高于HeLa-VEC细胞（26.62±3.49）%（P=0.0091），见图1D。这些结果表明，在HeLa细胞中过表达HK2可以促进细胞周期从G1期向S期转换。

2.2 HK2促进HeLa细胞的体外迁移和侵袭

细胞划痕实验结果显示，在观察48 h时，HeLa-HK2中细胞划痕的愈合速度快于HeLa-VEC细胞（P=0.0045），见图2A。Transwell体外迁移实验结果显示，过表达HK2后，每个视野下穿过Transwell小室的细胞数量（249.33±21.78）多于HeLa-VEC细胞数量（147.67±8.51），P=0.0017，见图2B。Transwell体外侵袭实验结果表明，过表达HK2后，每个视野下穿过Transwell小室的细胞数量（118.34±10.69）多于HeLa-VEC细胞（45.11±10.34），P=0.015，见图2C。这些结果提示过表达HK2后可以增强HeLa细胞体外迁移和侵袭的能力。

2.3 HK2通过Wnt/β-catenin信号转导通路上调Cyclin D1、MMP7和Slug蛋白表达

Western blot和免疫细胞化学检测结果表明，过表达HK2后，可以显著上调β-catenin、Cyclin D1、MMP7和Slug蛋白在HeLa细胞中的表达（P＜0.05），见图3A、B。萤火虫荧光素酶（TOP/FOP）实验结果也证实，过表达HK2后可增强Wnt/β-catenin信号转导通路活性（P=0.025），见图3C。

2.4 抑制Wnt/β-catenin信号转导通路活性可以消除HK2对HeLa细胞增殖及迁移的影响

在HK2过表达HeLa细胞中添加Wnt/β-catenin信号通路抑制剂（XAV-939）后，可以显著抑制β-catenin及Wnt/β-catenin信号通路下游蛋白Cyclin D1、MMP7和Slug在HeLa-HK2细胞中的表达（P＜0.05），见图4A。细胞计数和MTT实验表明，XAV-939可以抑制HeLa-HK2细胞的增殖（P=0.0095）和细胞活力（P=0.0083），见图4B～C。Transwell体外迁移和侵袭实验的结果也证实，XAV-939可以抑制HeLa-HK2细胞体外迁移（P=0.0065）和侵袭能力（P=0.0088），见图4D～E。上述结果提示，在HeLa-HK2细胞中使用XAV-939抑制Wnt/β-catenin信号转导通路活性后，可逆转HK2对HeLa细胞增殖、迁移和侵袭的促进作用。

图2 HK2增强HeLa细胞迁移(A,B) 和侵袭(C)的能力Figure 2 Effect of HK2 on migration(A,B)and invasion(C) abilities of HeLa cells detected by wound-healing assay and Transwell assay

图3 HK2增强Wnt/β-catenin信号转导通路活性Figure 3 HK2 enhanced activity of Wnt/β-catenin signaling pathway in HeLa cells

图4 抑制Wnt/β-catenin信号转导通路活性可以减弱HK2对HeLa细胞增殖、迁移和侵袭的影响Figure 4 Treating with the Wnt/β-catenin inhibitor XAV-939 inhibited HK2-induced HeLa cell growth,migration and invasion

3 讨论

宫颈癌是一种妇科易发的恶性肿瘤，好发于20～50岁妇女，近年来宫颈癌的发病逐渐呈现出年轻化的倾向，其发展是一个缓慢的、多阶段的过程，在多种致癌因素的刺激下，宫颈鳞状上皮底层细胞增生活跃和分化不良，逐渐形成宫颈上皮的不典型增生，随着病情的进展，逐渐向鳞状上皮内病变、早期浸润癌、浸润癌发展[5]。

在葡萄糖代谢过程中，葡萄糖被己糖激酶磷酸化，转化为葡萄糖-6-磷酸，可以为肿瘤细胞的快速增殖提供能量支持。HK2被认为参与多种肿瘤细胞的生理过程，如神经胶质瘤[6]、胶质母细胞瘤[7]、结肠癌[8]和肝细胞癌[9]等，而HK2表达缺失可以抑制细胞增殖、促进细胞凋亡、抑制肿瘤生长。既往研究[10-11]发现HK2在宫颈癌中呈高表达状态，通过PI3K/Akt信号转导通路，可以促进SiHa细胞的增殖和迁移。本研究中，过表达HK2可以显著促进宫颈癌HeLa细胞的增殖和细胞活力。流式细胞术分析结果发现，在HeLa-HK2细胞中G0/G1期细胞数明显少于HeLa-VEC细胞，S期细胞数明显多于HeLa-Vec细胞。上述结果表明，在HeLa细胞中，HK2通过促进细胞周期从G0/G1期向S期的转换，促进细胞增殖。此外，在HeLa细胞中过表达HK2也可以显著增强HeLa细胞体外迁移和侵袭的能力。

在肿瘤细胞中，多种信号转导通路参与调节细胞的增殖、迁移和侵袭，而且糖代谢也与多种细胞内信号转导通路相关。那么HK2能否通过调节细胞内信号转导通路参与肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭？本研究中，HK2可以显著上调Wnt/β-catenin信号转导通路中关键蛋白β-catenin在HeLa细胞中的表达。TOP/FOP实验结果也证实，HK2可以增强Wnt/β-catenin信号转导通路在HeLa细胞中的活性。既往研究[12]证实，Wnt/β-catenin信号转导通路通过调节其下游蛋白的表达，参与肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。本研究进一步发现，HK2可以上调Wnt/β-catenin信号转导通路下游蛋白Cyclin D1、MMP7和Slug的表达。

Cyclin D1作为一种细胞周期调节蛋白可以调节多种肿瘤细胞的增殖，而MMP7和Slug是上皮间质转化（EMT）过程中的两个重要蛋白，参与多种肿瘤细胞EMT进程，促进细胞的迁移和肿瘤的转移[13]。此外，在HK2过表达HeLa细胞中使用Wnt/β-catenin信号转导通路抑制剂XAV-939后，可以抑制β-catenin、Cyclin D1、MMP7和Slug蛋白的表达，同时也可以减弱HK2在HeLa细胞中对增殖、迁移和侵袭的促进作用。因此，本研究推测，HK2通过Wnt/β-catenin信号转导通路上调Cyclin D1、MMP7和Slug的表达，促进细胞体外增殖、迁移和侵袭。

综上所述，本研究发现HK2高表达可以促进宫颈癌细胞HeLa体外的增殖、迁移和侵袭；HK通过激活Wnt/β-catenin信号转导通路，可以上调Cyclin D1表达，促进HeLa细胞的增殖；HK2通过激活Wnt/β-catenin信号转导通路，可以上调MMP7和Slug的表达，增强HeLa细胞的体外迁移和侵袭。上述结果提示HK2通过增强Wnt/β-catenin信号转导通路活性可以在HeLa细胞中发挥促进增殖、迁移和侵袭的作用。但HK2作为一种己糖激酶是通过直接还是间接作用调节Wnt/β-catenin信号转导通路活性的分子机制仍有待进一步的研究。