CEA、PAK5联合循环肿瘤细胞对ⅢB期胃癌患者术后复发转移的早期精准预测

史健，袁梦

0 引言

中国胃癌患者平均死亡率高达20/10万，占恶性肿瘤的第一位[1]。究其原因可能与原发肿瘤致病基因突变、药物的敏感度反应、耐药机制多样性等异质性相关[2]，为此，探求早期预测生物学进展标志物成为研究热点。本研究应用ELISA法、多重RNA/DNA原位分析等方法，对ⅢB期胃癌术后患者辅助化疗后随访期内进行动态检测外周血癌胚抗原（carcino-embryonic antigen,CEA）、p21活化激酶5（p21-activated kinase 5,PAK5）、循环肿瘤细胞（circulating tumor cells,CTC）以及同时期CT检查，以期达到早期生物学预测复发转移的目的。

1 资料与方法

1.1 临床资料

收集2015年1月—2017年12月河北医科大学第四医院肿瘤内科胃癌根治术后完全缓解的患者150例。入组条件：术前晨空腹肘部外周静脉血CEA值超过正常值的5倍、术后病理诊断为胃腺癌ⅢB期（T4bN1-2M0、T4aN2M0、T3N3M0）（按照AJCC第七版）。治疗方案以奥沙利铂或紫杉醇为主的方案辅助化疗6周期，其中多西他赛为主方案72例，奥沙利铂为主方案78例。后续定期随访，每3月进行CEA检测和影像学评估。

分组标准：随访期内血浆CEA检测正常患者设为对照组，共50例。随访期内第一次CEA升高超过正常值5倍患者为实验组，共100例，同时按CEA水平增高不同情况，再分为两组：CEA进行性增高组（实验A组）和无规律增高组（实验B组）。

入组患者基线情况：入组时患者整体分期、化疗周期数、血浆癌胚抗原CEA、PAK5、CTC和影像学检查肿瘤病情评估差异均无统计学意义（P＞0.05）。所有患者按照住院或门诊评估的方式进行随访，随访截至2017年12月31日。

1.2 检测方法和频次

应用ELISA、多重RNA/DNA原位分析等方法，分别采集两组患者不同时刻的晨空腹肘部外周静脉血，检测血浆中癌胚抗原CEA、PAK5和CTC的水平。CEA由我院生化室完成检测。PAK5和CTC均由广州益善公司协助完成检测。

动态检测时间点的选择：T0：术前癌胚抗原超过正常值5倍；T1：术后辅助化疗6周期后；T2：CEA首次超过正常值5倍，本研究将其确定为生物学进展时间；T3：首次CT证实进展和（或）无影像学进展的患者随访截止时间。实验组动态检测三次（T1、T2、T3），对照组动态检测两次（T1、T3）。

1.3 各指标阳性判定标准

癌胚抗原CEA阳性标准：CEA的正常值为＜5 ng/ml。超过正常值的5倍为生物学进展阳性。CTC阳性标准：CTC检测分为上皮型、混合型、间质型，其中上皮型认定为良性，混合型认定为生物学进展，间质型认定为恶性复发转移，即为影像学进展，见图1。PAK5检测标准：根据表达强度分为无表达、低表达、中表达、高表达。本研究判定标准：无表达和低表达为阴性，中表达和高表达为阳性，其中中表达/总细胞数的比率判定为生物学进展；高表达/总细胞数的比率判定为影像进展，见图2。

图1 循环血肿瘤细胞CTC分型表达Figure 1 CTC typing of circulating tumor cells in blood

图2 多重RNA原位分析PAK5表达情况Figure 2 In situ analysis of PAK5 expression by multiple RNA

2 结果

2.1 CEA与胃癌术后疾病进展关系

截至随访时间，对照组50例患者中均未见CEA增高，影像学未见明确病灶。实验两组中，按照生物学进展时间（T2）：实验A组为3～24月，中位时间13月。实验B组为4～32月，中位时间22月。按照影像进展时间（T3）：实验A组39例（78%）进展，出现时间为5～8月，中位时间为6.2月。实验B组12例（24%）进展，出现时间为4～15月，中位时间为10.6月。实验A组较B组更能提示复发转移。

2.2 CTC变化情况与胃癌术后疾病进展关系

T2时，实验A组混合型和间质型之和/总单细胞数比值大于30%，提示生物学进展；间质型细胞数≥1在两实验组之间有差异，但无统计学意义。T3时，实验A组混合型和间质型之和/总单细胞数比值大于50%，提示影像学进展。间质型细胞数≥1在两实验组之间有差异，但病例数尚少，未行统计学分析，见表1。

2.3 PAK5变化与胃癌术后疾病进展关系

T2时，无表达、低表达、中表达数据没有偏移，两组间高表达数据有偏移；T3无表达、低表达数据没有偏移，两组间中、高表达数据有偏移。因为病例数尚少，未行统计学分析，见表2。对明确影像学进展的51例患者的CTC细胞进行PAK5检测，中表达数值为13.6%～83%，高表达数值为37.8%～100%。

表1 实验组CTC变化与ⅢB期胃癌术后患者肿瘤进展的关系Table 1 Relation between CTC change and tumor progression in patients with stage ⅢB gastric cancer after operation

表2 PAK5表达与ⅢB期胃癌术后患者复发进展的关系Table 2 Relation between PAK5 expression and tumor progression in patients with stage ⅢB gastric cancer after operation

2.4 实验组CEA、PAK5、CTC三者阳性表达一致性

由于实验B组仅有12例（24%）患者影像学提示进展，病例数尚少，未行统计学分析。对实验A组39例影像学提示进展患者进行比较，T2时，CTC和PAK5、CEA判定的一致性为82%。T3时，和PAK5、CEA判定的一致性为94% 。

3 讨论

中国ⅢB期胃癌术后5年生存率仅为15%～35%，究其原因在于部分患者术后即发生早期转移。临床上常常将癌胚抗原（CEA）作为ⅢB期胃癌术后随访复发转移的生物标志物[3]。本研究CEA进行性增高组（实验A组）有78%的患者肿瘤影像证实进展，有利于早期诊断复发转移。而CEA无规律增高组（实验B组）仅有24%提示肿瘤影像学进展，单指标检测存在假阳性，与文献报道CEA具有非特异性、易受炎性反应性疾病的干扰相一致。因此，提高预测指标的准确性成为临床研究的趋势，才能更好地避免给患者带来精神压力和过度治疗的可能性。

有研究报道CTC的间质型细胞具有恶性行为[4-6]，但对于混合型的恶性度报道不一，实体瘤的异质性导致的胃癌CTC的阳性标准不同于乳腺癌，尚无明确共识。本研究数据表明间质型细胞数大于1可早期预测影像学进展。但对于混合型的恶性度报道不一，本研究考虑混合型细胞具有恶性变的趋势，疾病进展演变成间质型，其演变过程是从肿瘤生物学进展发展到影像学进展的过程，可以很好地预测影像学进展。本研究应用统计学分析（混合型+间质型）/总单细胞数比值大于30%可早期预测生物学进展可能；（混合型+间质型）/总单细胞数比值大于50%可早期预测影像学进展可能。由于混合型细胞中有良性细胞成分和恶性成分，因本研究例数尚少，目前尚无更好的方法区分生物学进展，待扩大样本数后进一步进行验证。

为了更好的推算混合型向间质型细胞的演化时间，本研究增加检测了一种上游癌基因P21活化激酶亚型PAK5，有学者对恶性肿瘤组织标本检测数据表明PAK5过度表达或突变激活，参与了部分恶性实体瘤发生、发展[7-14]，但在胃癌中的研究较少[15-16]。本研究数据表明PAK5参与了胃癌细胞生长增殖的调节。PAK5的无/中表达表明肿瘤细胞进入复制分裂期的增殖数目较少、恶性度低；PAK5的中/高表达表明肿瘤细胞进入增殖期数目多、恶性度高。本研究明确影像学进展的51例患者生物学进展时刻时PAK5的中表达数值为13.6%～83%，高表达数值为37.8%～100%。结果显示PAK5的中/高表达可预测生物学进展，实验数据范围较广，我们考虑PAK5检测的敏感度和特异性可能会导致假阳性/假阴性。但因为例数较少，未行统计学分析。

本研究数据单因素检测存在误差，对癌培抗原进行性增高组影像学进展确定进展的39例患者进行CEA、PAK5、CTC三者联合检测的一致性上，预测生物学进展的一致率为82%；预测肿瘤影像学进展的一致率为94%，联合检测可提高预测率，降低检测误差。

因此，联合动态检测CEA、PAK5、CTC预测ⅢB期胃癌术后生物学进展，更早于影像进展诊断，可降低单一指标的假阳/阴性率，提高检出阳性率，防止漏诊、误诊的发生。