重金属对鲫鱼的毒性及其相关生物标志物的研究

刘小真，钟瑾慧，熊 戬

(南昌大学资源环境与化工学院；鄱阳湖环境与资源利用教育部重点实验室，江西 南昌 330031)

工业化进程的加快以及人类生产活动的不规范化等多因素使得环境中存在大量的重金属污染物，由此导致的生态危害和健康损害事件时有发生[1]。重金属是一类有潜在危害的重要污染物，它极难降解、易被生物富集并有生物放大效应等特点，有较大的生态危害性[2]。

环境中广泛存在铅、镉污染，过量摄入铅、镉对水生生物产生系列毒性效应，引起鱼体生物反应异常(游动能力下降、身体侧翻)，破坏鱼体器官组织结构、引起组织病变，包括改变酶活性、损伤细胞器、致死等[3]；因此研究重金属的生态毒性尤为重要。铅、镉在低浓度下可引起机体的氧化应激和氧化损伤[4-5]，通过检测鱼体内相关指标可以判断其受重金属的影响程度。胡蓉[6]、卓丽玲[7]等研究鲫鱼对Pb2+、Cd2+24 h的最大耐受质量浓度分别为15、0.54 mg·L-1，铅、镉引起的氧化应激可以通过抗氧化酶的活性变化来反应[8-9]。抗氧化酶是生物体受到氧化胁迫和损伤情况下的主要生物标志物，生物受到污染胁迫时会刺激体内产生活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，进而诱导抗氧化酶系统的响应，其响应是为了一定程度上消除活性氧自由基，维系膜系统的稳定性，降低细胞受伤害的程度[10-11]。关于重金属诱导鱼类氧化应激的研究大多集中在毒性机制上[12]，早期预警生物标志物的研究有待加强。

1 材料与方法

1.1 蚌湖地理位置介绍

鄱阳湖位于江西省北部，地理坐标28°22′-29°45′N,115°47′-116°45′E，是一个过水性、吞吐型的浅水湖泊[14]。蚌湖位于鄱阳湖西北，属于鄱阳湖边缘的一个天然湖泊(29.268°-29.271°N，115.934°-115.979°E)，面积约80 km2；蚌湖及其周边水域存在明显的水位波动性，丰水期鄱阳湖水体越过贯通口进入蚌湖，此时蚌湖与鄱阳湖连成一整体水域，枯水期蚌湖水位降低，形成与多个外界隔离的湖泊[15]。(见图1)

蚌湖水体pH值为7.56±0.44，水质硬度在100～130 mg·L-1，水中氧浓度保持在饱和浓度的70%～115%。参照相关文献[15]及《土壤环境质量标准》(GB 15618—1995,2008)，蚌湖表层沉积物中Pb、Cd浓度分别达到二级、三级标准(见表1)。

表1 铅、镉土壤环境质量标准值/(mg·kg-1)

1.2 实验对象的获取及饲养

蚌湖内有丰富的鲫鱼和鲤鱼，鲫鱼是水生生态系统食物链中极为重要的一环，它能够对水环境中物理、化学和生物因素的变化做出敏锐的反应，所以在评价环境污染及生态风险中表现出突出的实用价值[16-17]。其主要优点有：分布广泛，容易获得；个体适中，适于实验室饲养；是蚌湖流域水生生物优势物种，有代表性。因此染毒实验以鲫鱼为研究对象，本研究所用鲫鱼均捕获自蚌湖，选择鲜活、无损伤，且体型大小相似，体长(8.0±0.5)cm，体重(12.0±0.5)g。鲫鱼在实验室驯养至少7 d(期间死亡率低于10%)，实验水质条件真实模拟蚌湖水环境状况，水温维持(20±2)℃，pH控制范围为6.5～8，溶解氧量为7 mg·L-1以上，水体硬度控制在100～130 mg·L-1(CaCO3)，驯养期间每天喂食1次(喂食0.5 h后清除残饵及粪便)，实验前24 h停止喂食。

1.3 主要试剂及仪器

仪器：可见分光光度计(722G，上海分析仪器有限公司)、漩涡混合器(XW-80A，上海精科实业有限公司)、电热恒温培养箱(DRP-9163型，上海森信实验仪器有限公司)、高速台式离心机(GT16-3A，北京时代北利离心机有限公司)等相关基础实验仪器。

试剂：乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、考马斯亮蓝(G250)、牛血清白蛋白(BSA)等，MDA、T-SOD、MTs和ECOD测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.4 实验设计

重金属染毒实验：选用对重金属敏感的4种抗氧化酶研究鲫鱼由Pb、Cd引起的氧化应激反应。为避免水环境综合因素的影响，依据蚌湖表层沉积物重金属污染情况及前期淡水环境中检测的Pb、Cd含量(0.01，0.001 mg·L-1)，以《地表水环境质量标准》为依据设置Pb2+，Cd2+两种重金属的染毒实验浓度，设置4个浓度梯度，最高浓度设置为Ⅴ类水质限值的5倍。具体浓度设置如表2所示。

表2 染毒试验重金属浓度/(mg·L-1)

鲫鱼染毒实验选取规格大小一致、反应灵敏个体随机分为9个处理组，包括一组空白对照和两种重金属分别设置的四个暴露浓度组，每个处理组3个重复，每个重复10尾鱼。实验用水均为曝气3 d以上的自来水(去除水中的溶解氯)；实验期间pH值、水质硬度、溶解氧均符合蚌湖水质参数，水温维持在(20±2)℃，实际鲫鱼的生物量控制在≤0.5 g·L-1。采用动态染毒法，各鱼缸中溶液体积均为15 L，每天更新30%的试验液，持续曝气，实验期间不投饵料，染毒时间为8 d。随机选取鱼体作为供试材料，迅速解剖鱼体，用吸水纸吸干组织表面水，摘取肌肉、脑、肝脏、鳃四种组织放入-20 ℃冰箱中贮存。MDA、T-SOD、MTs和ECOD等酶活性，均采用南京建成生物工程研究所的商品试剂盒测试，其对应测试步骤严格按照试剂盒的使用说明执行。

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1.5 组织匀浆制备

(1)称取鲫鱼组织(0.2～1.0)g在2～5 mg在冰生理盐水中漂洗，除去血液并用滤纸吸干，放入10 mL小烧杯内；(2)将鲫鱼组织在0.86%冷生理盐水中剪碎并倒入玻璃匀浆管中，将捣杆垂直插入套管中，上下研磨数十次，充分研碎使组织匀浆化；(3)将制备好的匀浆用冷冻离心机(转速2 000 r·min-1)离心10～15 min，收集离心后的上清液为匀浆液。

2 结果与分析

2.1 鲫鱼Pb2+、Cd2+染毒实验中MDA变化情况

对鲫鱼进行Pb2+、Cd2+染毒试验，MDA测定结果如图2所示。

暴露于Pb2+溶液8 d后，肌肉MDA除0.1 mg·L-1浓度处显著高于对照组(P<0.05)，其余浓度暴露下肌肉MDA含量与对照组无明显差异；脑组织中MDA随浓度呈波动变化，且与对照组无显著差异；肝脏中各浓度组MDA显著高于对照组(P<0.05)，且与暴露浓度呈负相关关系。

随着Cd2+浓度的逐步增加，肝脏各暴露组MDA随Cd2+浓度升高含量增加，呈正相关且与对照组有显著差异(P<0.05)；肌肉和腮中MDA呈相似的波动变化，都在0.01 mg·L-1浓度处出现下降现象；脑MDA随浓度升高先增加，随后在0.5 mg·L-1浓度处出现下降。

Pb2+、Cd2+暴露后对鲫鱼各组织MDA的影响如图2所示，由图中可以看出Pb2+暴露下除脑组织外各组织MDA随浓度均有先增加后下降的趋势。鱼体细胞受到氧化胁迫产生ROS，ROS容易攻击生物膜上的磷脂、膜受体等不饱和脂肪酸类大分子物质，从而引起脂质发生过氧化[18]。MDA是脂质过氧化的最终产物，它反映了机体受氧化损伤的程度。各Pb2+暴露组实验开始后，鲫鱼肝脏和腮MDA含量显著升高，表明Pb2+胁迫下，机体ROS含量增多造成脂质过氧化程度增强。而后暴露浓度升高，鱼体无法适应高浓度暴露环境，MDA含量下降，机体受到损伤逐渐倾向于氧化状态。Cd2+暴露下脑组织中出现同样现象，而肝脏MDA在Cd2+暴露下表现出明显的剂量效应关系。卓丽玲[7]、金叶飞[19]等相关研究表明，染Cd2+组随暴露浓度的增加，鲫鱼肌肉、肝脏、腮的Cd蓄积量均出现显著增加(P<0.05)，各组织蓄积量顺序为：肝脏>鳃>肌肉；肝脏组织富集系数及敏感程度大于其他组织，主要原因为肝脏是鱼体蓄积重金属及解毒的主要器官，是镉代谢的中心区域。所以呈现出鲫鱼肝脏MDA含量明显高于其他组织。图中看出肝脏组织在此浓度范围内对Cd2+浓度变化敏感，能够成为Cd污染的良好指示剂。这与王学锋[20]等对Cd2+暴露下鲫鱼肝脏MDA活性变化的相一致。

2.2 鲫鱼Pb2+、Cd2+染毒实验中T-SOD变化情况

对鲫鱼进行Pb2+、Cd2+染毒试验，T-SOD活性测定结果如图3所示。

暴露于Pb2+溶液8 d后，肌肉T-SOD活性随暴露浓度先升高，而后在0.5 mg·L-1浓度处活性降低，与肌肉MDA变化趋势一致；脑和腮组织中T-SOD呈现波动变化；肝脏T-SOD在0.01 mg·L-1处受到显著诱导(P<0.05)，随后活性随浓度逐渐降低，呈负相关。

暴露于Cd2+溶液8 d后，四种组织T-SOD呈波动变化，活性均在高暴露组出现下降趋势；肌肉与肝脏T-SOD在0.05 mg·L-1Cd2+暴露下活性下降，脑组织T-SOD在0.001 mg·L-1Cd2+暴露下受到显著诱导(P<0.05)，随后波动变化至对照组水平。

2.3 鲫鱼Pb2+、Cd2+染毒实验中MTs变化情况

对鲫鱼进行Pb2+、Cd2+染毒试验，MTs活性测定结果如图4所示。

暴露于Pb2+溶液8 d后，MTs在四种组织中酶活性均出现显著上升趋势(P<0.05)，脑、肝脏两组织活性变化相似，均与暴露浓度呈正相关关系，在0.5 mg·L-1Pb2+浓度处呈现最大诱导；肌肉MTs出现先升高后在0.5 mg·L-1Pb2+浓度处活性降低；腮中活性呈现波动变化。

暴露于Cd2+溶液8 d后，肌肉、脑、肝脏中MTs活性变化趋势一致，MTs在前3个暴露渐升高，在0.01 mg·L-1Cd2+处达到最大值且与对照组有显著差异(P<0.05)，而后0.05 mg·L-1Cd2+浓度处活性回复至对照组水平；而鳃组织MTs随暴露浓度增加活性升高，剂量效应关系明显。

MTs是唯一一种在重金属代谢中起明确作用的非酶低分子蛋白质，具有抵御氧化损伤的作用[24-25]。MTs活性变化过程与前两种酶相似，随暴露浓度升高MTs活性上升以应对机体毒性损伤。MTs对于重金属胁迫具有特异性，能够与有毒金属如Cd、Hg相结合并清除活性氧自由基，MTs作为重金属尤其是Cd暴露的生物标志物已广泛应用于实践中[26]。从图中可以看出脑、肝脏MTs与Pb暴露浓度呈正相关关系，可以作为Pb污染的理想生物标志物；腮组织与Cd暴露浓度呈正相关，可以作为该浓度范围内Cd暴露的良好指示剂。这与Hamza-Chaffai[27]对蛤的原位重金属暴露研究结论一致。

2.4 鲫鱼Pb2+、Cd2+染毒实验中ECOD变化情况

对鲫鱼进行Pb2+、Cd2+染毒试验，ECOD活性测定结果如图5所示。

暴露于Pb2+溶液8 d后，4种组织中ECOD活性均出现先升后降的变化；脑和腮暴露组活性呈现波动变化；肌肉和肝脏活性变化均表现为先升后降。随着Cd2+浓度的逐步增加，脑与鳃组织间ECOD活性变化一致；肌肉与肝脏中变化趋势类似，均在0.005 mg·L-1浓度下活性最大，尤其肝脏ECOD在0.005 mg·L-1Cd2+暴露下受到显著诱导(P<0.05)，明显高于其他暴露组。

ECOD在各组织中未表现出明显规律。肝脏ECOD在0.005 mg·L-1Cd2+浓度下急剧增加至最大值，ECOD能够催化细胞色素P450酶系CYP的活性，CYP是生物体内重要的代谢解毒酶，说明该浓度处酶活性显著诱导以催化CYP的活性达到机体解毒的目的；而后浓度升高酶活性下降表明机体在该暴露浓度下逐渐氧化损伤。

3 结论

重金属Pb、Cd对水体鲫鱼染毒实验研究表明：

在0.5 mg·L-1Pb2+浓度范围内鲫鱼脑和肝脏组织MTs活性与Pb2+暴露浓度高度正相关，脑组织和肝脏组织MTs可以作为评价该浓度范围内Pb污染的理想生物标志物。在0.05 mg·L-1Cd2+浓度范围内，肝脏MDA、鳃组织MTs与Cd2+暴露浓度相关性高，呈现显著的剂量效应变化(P<0.05)，是水环境中该浓度范围内Cd污染预警的有效生物标志物。

通过染毒实验结果对比，可以看出鲫鱼体内的毒性代谢机理非常复杂，不同重金属的暴露实验，抗氧化防御系统中各酶活性的变化，侧面反映蚌湖水质条件下重金属Pb、Cd对鲫鱼肌肉、脑、肝脏、腮组织的氧化损伤。