利奈唑胺耐药金黄色葡萄球菌耐药机制分析*

高硕，周万青，朱宏，周辉，张燕，张之烽，曹小利，沈瀚

(南京大学医学院附属鼓楼医院检验科，南京 210008)

利奈唑胺作为噁唑烷酮类抗菌药物，广泛应用于革兰阳性球菌引起的严重感染，是治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)的一个重要选择[1]。然而，在全球范围内，利奈唑胺耐药金黄色葡萄球菌感染病例相继出现，给临床治疗带来严峻挑战[2]。目前已知的利奈唑胺耐药主要机制是23S rRNA基因V区核苷酸突变、核糖体L3和(或)L4突变以及菌株携带氯霉素-氟甲砜霉素耐药基因(chloramphenicol-florfenicol resistance，cfr)[3]。近年发现，介导粪肠球菌利奈唑胺耐药的决定基因optrA[4]在凝固酶阴性葡萄球菌中也有检出[5]，以及由新型poxtA基因介导的利奈唑胺耐药MRSA被检出[6]，进一步揭示革兰阳性菌对利奈唑胺耐药机制的多元化。本课题组前期研究发现，获得cfr基因或 23S rRNA G2576T突变是导致凝固酶阴性葡萄球菌对利奈唑胺耐药的主要机制[7]，并存在江苏地区内的克隆传播。

美国LEADER项目2011—2015年数据显示，金黄色葡萄球菌利奈唑胺不敏感率为0.1%[8]。2018年CHINET中国细菌耐药监测结果显示，甲氧西林耐药凝固酶阴性葡萄球菌(methicillin resistant coagulase-negativeStaphylococcus，MRCNS)和甲氧西林敏感凝固酶阴性葡萄球菌(meticillin-sensitive coagulase-negativeStaphylococcus，MSCNS)对利奈唑胺的耐药率分别为0.5%和0.1%，未检出利奈唑胺耐药的MRSA[9]。而本课题组在对我院临床分离金黄色葡萄球菌药敏监测中检出1株利奈唑胺耐药MRSA菌株，并利用全基因组测序技术分析其对利奈唑胺的耐药机制，现报道如下。

1 材料和方法

1.1菌株 收集南京大学医学院附属鼓楼医院2019年1月至12月临床分离非重复金黄色葡萄球菌905株，主要分离自痰液(52%)、分泌物(29%)、血液样本(7%)及其他类型标本(12%)。所有菌株均经Vitek 2 Compact GP板卡鉴定并经Vitek质谱仪复核。金黄色葡萄球菌ATCC 29213、cfr基因阳性对照头状葡萄球菌SA10106为本实验室保存[10]。

1.2主要试剂与仪器 Vitek 2 Compact 全自动鉴定仪及配套 GP 鉴定卡、GP67 药敏卡、Vitek MS(法国生物梅里埃公司),利奈唑胺 E-test试纸条(郑州安图生物公司),DNA提取试剂盒及胶回收试剂盒(北京天根公司),2×Taq Mix(DBI公司),LB肉汤(科玛嘉公司),PCR引物由上海生工公司合成；2720 Thermal Cycler PCR仪、ABI 3730XL基因测序仪(美国ABI公司)；Gel-Doc XR型凝胶成像分析系统(美国Bio-Rad 公司)。

1.3药敏试验 用Vitek 2 Compact 配套 GP67 药敏卡检测菌株对常规药物的敏感性。用E-test法复测利奈唑胺耐药菌株对利奈唑胺的最低抑菌浓度(MIC)，判定标准参照美国临床和实验室标准化协会(CLSI)2019年标准[11]。

1.4DNA提取 挑取纯培养菌落接种至LB液体培养基，37 ℃、180 r/min培养16 h，用DNA提取试剂盒提取菌液基因组DNA，按试剂盒说明书进行操作。所提核酸用于全基因组测序及基因扩增。

1.5PCR扩增和序列分析 参照文献[7]合成23S rRNA第V功能区基因、cfr基因以及optrA基因，引物序列见表1。反应体系为50 μL：2×Taq Mix 25 μL，DNA模板2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL，ddH2O 19 μL。 PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30个循环；72 ℃ 7 min。PCR产物行15 g/L琼脂糖凝胶电泳，阳性扩增产物经电泳后切胶回收，用柱层析法纯化后用ABI 3730XL基因测序仪进行Sanger双向测序(由上海生工公司完成)，正、反向测序片段采用DNAMAN8软件拼接，结果经BLAST与GenBank进行比对。

表1 靶基因PCR引物序列及产物大小

1.6全基因组测序分析 委托上海泽塔生物科技公司用Illumina HiSeq 2000测序系统进行全基因组DNA测序。简要步骤：对样本DNA进行双向(paired-end，PE)测序，构建450 bp文库；对测序结果进行质量剪切后，用MicrobeTrakr plus v. 0.9.1软件对序列进行拼接，得到最优的组装结果。用GeneMarkS+v.4.11基因注释软件对测序结果进行预测。将预测得到的基因序列分别与KEGG、COG、GO数据库进行BLAST比对，获得预测基因的注释信息。利用Center for Genomic Epidemiology 网站(http://www.genomicepidemiology.org)中的LRE-Finder 1.0、ResFinder 3.2、VirulenceFinder 及 PlasmidFinder 软件对耐药基因、毒力基因、利奈唑胺耐药相关突变及质粒分型进行预测分析。

1.7多位点序列分型(multilocus sequence typing，MLST) 用PCR方法进行菌株MLST分析[12]。参照金黄色葡萄球菌MLST数据库(https://pubmlst.org/saureus/)中引物序列，合成金黄色葡萄球菌7个管家基因arc、aro、glp、gmk、pta、tpi和yqi扩增引物，并依据网站条件进行PCR扩增和测序。PCR反应体系及序列分析同1.5。通过将测序序列与数据库进行比对，获得菌株MLST型别。pta等位基因型未在数据库中获得匹配，将序列及测序文件递交至Sequence/profile definitions数据库(https://pubmlst.org/bigsdb?db=pubmlst_saureus_seqdef)以获得新的等位基因编号及ST型别。

2 结果

2.1利奈唑胺耐药菌株筛选 905株金黄色葡萄球菌对青霉素、环丙沙星、红霉素、克林霉素、四环素、复方磺胺甲噁唑和左氧氟沙星的耐药率分别为97.2%、38%、59.7%、29.3%、34.7%、5.9%和38.1%，未检出万古霉素不敏感菌株，MRSA检出率为49.8%，检出1株(0.1%)利奈唑胺耐药菌株(实验室编号SA12095)。该菌株对万古霉素和复方磺胺甲噁唑敏感，对青霉素、苯唑西林、环丙沙星、红霉素、克林霉素、四环素及左氧氟沙星均耐药；E-test检测利奈唑胺MIC值为16 mg/L。

2.2耐药基因检测结果 PCR结果显示SA12095携带cfr基因，未检出optrA基因。见图1。经测序，23S rRNA V 区发生T2337G和C2370G 2个核苷酸位点的突变。

注：M，2000 bp DNA ladder maker；1，cfr基因阳性对照(SA10106)；2，cfr基因(SA12095菌株)；3，optrA基因(SA12095菌株)；4，23S rRNA V区(SA12095菌株)；5，23S RNA V区(ATCC 29213菌株)。

2.3基因组概述 SA12095基因组大小为2 949 411 bp，GC含量为48.5%，总基因数为3 023个，基因组含有2 876个编码序列、59个tRNA编码基因以及7个完整的rRNA基因编码的操纵子。耐药基因预测分析显示，该菌株携带cfr、norA、aadD、spc、aac(6′)-aph(2′′)、erm(A)、tet(K)、blaZ、mecA及lnu(A)。毒力基因主要有sak、scn、hlgA、hlgB、hlgC、lukD、lukE、sea、sec、sel、sem、aur、splA及splB。质粒分型预测主要为携带Increp7a、Increp5a、Increp19及Increp16的质粒。全基因序列提交至NCBI数据库，GeneBank号为JAANYO000000000。

2.4MLST结果 经PCR扩增及测序，SA12095菌株管家基因pta序列与数据库中pta249相比存在1个碱基突变(A39536T)。将序列上传至金黄色葡萄球菌MLST Sequence/profile definitions数据库，获得新的等位基因型为pta731，获得7个位点(arc/aro/glp/gmk/pta/tpi/yqi)的等位基因编码依次为1、4、1、4、731、1、10，上传至上述数据库获得SA12095菌株ST型为新型ST5985。

3 讨论

本文对我院2019年度临床分离金黄色葡萄球菌进行药敏监测，发现1株(0.1%)利奈唑胺耐药菌株，分离率与文献报道相近[8]。虽然目前本院临床分离金黄色葡萄球菌对利奈唑胺耐药率较低，但仍需加强监控，早期发现并实施可能的院内播散流行的阻断措施。目前报道的利奈唑胺耐药MRSA ST分型主要有ST36[13]及ST5[14-15]等，本文分离SA12095菌株pta等位基因为新的基因型，并被 MLST 数据库确认为新型ST5985。

利奈唑胺主要通过与细菌50S核糖体亚基的肽基转移酶中心(peptidyl transferase center，PTC)结合，抑制蛋白质的合成从而发挥抗菌作用。细菌对利奈唑胺耐药的主要机制之一是细菌23S rRNA V区点突变，导致药物与靶位亲和力减低，其中以G2576T点突变发生率最高[2,7]。姚伟明等[16]对利奈唑胺诱导耐药的MRSA菌株进行全基因组测序发现，23S rRNA V区发生G2447T突变。Wu等[17]对临床患者血液中检出的利奈唑胺耐药MRSA进行全基因组测序分析，发现存在23S rRNA V区G2576T和G2234A位点突变。但除G2576T外，对于其他突变位点与利奈唑胺耐药的相关研究数据仍缺乏。不同于此前的报道，我们通过PCR联合Sanger测序技术以及全基因组测序技术发现SA12095菌株存在23S rRNA V区 T2337G和C2370G 2个新的核苷酸突变位点。由于该菌株同时检出cfr基因而未检出optrA基因，我们推测，SA12095菌株对利奈唑胺耐药与菌株携带cfr基因有关。近年来由cfr介导的利奈唑胺耐药菌株在一些国家引起暴发流行[18]。有报道显示cfr基因位于pLRSA417质粒上，因此需警惕耐药性在不同种属细菌之间的传播[15]。本院此前检出cfr基因介导利奈唑胺耐药的头状葡萄球菌的流行[10]。最近发现江苏地区流行的耐利奈唑胺凝固酶阴性葡萄球菌主要由cfr基因和23S rRNA Ⅴ区 G2576T突变造成，并存在头状葡萄球菌和人葡萄球菌的跨地区克隆播散[7]。因此，对于SA12095菌株中cfr基因的来源和定位研究将为可能的耐药基因传播及防控奠定理论基础。另外，全基因组测序分析提示SA12095菌株同时携带tet(K)、blaZ、mecA等基因，并与菌株对四环素、青霉素及苯唑西林耐药表型相一致。由此可见，全基因组测序分析可为耐药基因研究提供支持性数据。研究表明，利奈唑胺暴露可能是利奈唑胺耐药菌株感染的危险因素[13]，亦有耐药菌株在未使用过利奈唑胺患者的样本中检出的报道[14]。本文菌株分离自多发性骨髓瘤合并肺部感染患者痰液样本，该患者在SA12095检出前15 d有连续7 d的利奈唑胺使用史。因此，我们推测SA12095耐药性的产生可能与利奈唑胺暴露有关。

本文对耐药监测中所检出的1株利奈唑胺耐药MRSA进行全基因组测序并结合PCR及测序技术，揭示该菌株是由cfr基因介导的利奈唑胺耐药，并且为新型ST型MRSA(ST5985)，提示目前流行的利奈唑胺耐药MRSA仍为地区性散发。但携带可经质粒介导传播的cfr基因是可能造成其水平传播的危险因素，因此，建议临床密切监测耐药菌株的出现，并与医院感染控制部门合作，及时阻断进一步播散。