双甲酸涂靶法对丝状真菌鉴定的临床应用评价*

袁凯旋，赵越，凌勇，叶龙，胡雪姣，侯铁英

(广东省人民医院/广东省医学科学院检验科，广州 510080)

丝状真菌的临床感染趋势不断上升，给临床抗感染治疗带来严峻挑战。丝状真菌的分离与鉴定当前仍是临床微生物学检验中的一大难点。传统形态学鉴定方法受限于技术人员的鉴别能力，菌株缺乏特征性结构等，易导致鉴定错误。基因测序操作繁琐且对实验要求较高，耗时久，成本高，亦不适合常规开展。而基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/lonization time of light mass spectrometry,MALDI-TOF MS)技术可实现丝状真菌鉴定，其推荐乙腈-甲酸提取法存在菌株前处理操作繁琐，耗时较长的弊端。研究报道，建立双甲酸夹心法并经布鲁克microflex LT MALDI-TOF质谱系统进行丝状真菌鉴定，获得较高的鉴定率[1]。本研究拟探讨双甲酸涂靶法在Vitek MS全自动微生物质谱检测系统中对丝状真菌的鉴定能力，以优化Vitek MS系统对丝状真菌的前处理鉴定流程。

1 材料与方法

1.1菌株来源 收集2019年2月至2020年5月广东省人民医院临床分离丝状真菌212株，其中曲霉菌属175株、非曲霉菌属37株(包括镰刀菌属12株、毛霉目5株、弯孢霉属4株、青霉属3株、其他丝状真菌13株)。分离自痰标本79株、创面分泌物39株、耳道分泌物37株、肺泡灌洗液34株、组织标本15株、无菌体液标本8株。

1.2主要仪器与试剂 PCR扩增仪(美国Bio-Rad公司)，Vitek MS质谱仪(IVD v3.0，法国生物梅里埃公司)，光学显微镜(日本Olympus公司)，ABI 3730 xl测序仪(美国赛默飞世尔公司)；Vitek MS一次性靶板、CHCA基质、25%甲酸、大肠埃希菌ATCC 8739(法国生物梅里埃公司)，乙腈(天津科密欧公司)，马铃薯葡萄糖培养基(广州迪景公司)，Ezup柱式真菌基因DNA抽提试剂盒、通用引物ITS1和ITS4、Taq PCR Master Mix(上海生工生物公司)，乳酸酚棉蓝(珠海贝索公司)，BigDyeTerminator试剂盒(美国赛默飞世尔公司)。

1.3形态学初筛 将菌株接种于马铃薯葡萄糖培养基，28 ℃培养2～5 d，采用透明胶带法[2]。对菌丝大小、颜色、有无分隔、孢子种类、产孢方式及产孢结构、分生孢子颜色及大小等进行形态学初步鉴定，判断标准按文献[2]推荐方法。对于部分产孢不良菌株采用小培养法[3]进行辅助鉴定。

1.4基因测序 按照Ezup柱式真菌DNA抽提试剂盒说明书提取丝状真菌DNA，并采用ITS1与ITS4引物[4]进行PCR扩增。扩增体系为50 μL：Taq PCR Master Mix 25 μL，DNA模板5 μL，0.2 μmol/L上、下游引物各 2 μL，ddH2O 16 μL；扩增条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 60 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35个循环；72 ℃ 7 min。对无法鉴定至种的曲霉菌株进行β-tubulin[5]和钙调蛋白基因(Calmodulin)[6]扩增，引物信息见表1。β-tubulin和Calmodulin基因PCR扩增体系均为25 μL，包括Taq PCR Master Mix 12.5 μL，DNA模板3 μL，0.2 μmol/L上、下游引物各1 μL，ddH2O 7.5 μL。β-tubulin基因PCR反应参数：94 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，55 ℃45 s，72 ℃ 30 s，40个循环；72 ℃ 10 min。Calmodulin基因PCR反应参数除退火时间为30 s，其他参数不变。由赛默飞世尔科技(中国)公司用ABI 3730xl测序仪完成测序：读长500～1 000 bp，时间36 min～2 h，碱基精确度99.999%。测序结果经NCBI 和Mycobank数据库进行序列比对，种、属信息鉴定原则参照文献[7]。

表1 PCR扩增所用引物序列

1.5双甲酸涂靶法 参照文献[2]并作改进：在生物安全柜中，于一次性靶板孔位加0.5 μL 25%甲酸，用1 μL 接种环尾部刮取幼龄菌丝体(平均培养时间3 d)，对于难以刮取菌体真菌采用一次性无菌手术刀片(型号：15号)刮取，于靶孔位上研磨成菌悬液，自然干燥后加0.5 μL 25%甲酸，干燥后滴加1 μL CHCA基质，待干燥后进行检测，用Vitek MS数据库(IVD v3.0)进行判断。灭活效果监测：检测完成，取靶孔结晶物接种马铃薯葡萄糖培养基，28 ℃培养2～5 d，评价灭活效果。

1.6乙腈-甲酸提取法 依据制造商提供的方案：在生物安全柜中，用潮湿的拭子收集1～2 cm直径的丝状真菌，将其悬于含900 μL 70%乙醇的2 mL圆底无菌EP管中灭活10 min，涡旋震荡混匀；(10 000～14 000)×g离心2 min，弃上清液；待乙醇完全挥发后加入40 μL新鲜配制70%甲酸涡旋震荡混匀3 s，加入40 μL乙腈涡旋震荡混匀3 s；(10 000～14 000)×g离心2 min，立即取1 μL上清液涂靶板，待完全干燥后加1 μL CHCA基质，干燥后进行检测，用Vitek MS数据库(IVD v3.0)进行判断。

1.7统计学分析 用SPSS 21.0软件进行。2种方法的鉴定一致性采用Kappa一致性检验进行评价，Kappa<0.4时，一致性一般；0.4≤Kappa<0.75时，一致性较高；Kappa≥0.75时，一致性很好。

2 结果

2.1丝状真菌菌株分布 经形态学初筛和基因测序确认，212株丝状真菌中包括曲霉175株、镰刀菌属12株、毛霉目5株、弯孢霉属4株、青霉属3株和其他丝状真菌13株。曲霉包括烟曲霉63株、黄曲霉40株、黑曲霉25株、土曲霉28株、聚多曲霉10株、构巢曲霉6株、黄曲霉/米曲霉2株、杂色曲霉1株；镰刀菌属包括茄病镰刀菌9株，轮枝镰刀菌、增生镰刀菌、厚孢镰刀菌各1株。212株丝状真菌经基因测序鉴定至种、复合群、属水平的鉴定率分别为84.91%、100%、100%。见表2。

表2 基因测序法、双甲酸涂靶法、乙腈-甲酸提取法鉴定结果

2.2双甲酸涂靶法与乙腈-甲酸提取法鉴定结果 双甲酸涂靶法种、复合群、属鉴定率分别为43.87%、91.04%、91.04%；175株曲霉种、复合群、属鉴定率分别为44.00%、93.71%、93.71%，其中构巢曲霉100.00%鉴定至种，烟曲霉98.41%鉴定至种，聚多曲霉90.00%鉴定至种，土曲霉100.00%鉴定至复合群，黄曲霉92.50%鉴定至复合群，黑曲霉80.00%鉴定至复合群；12株镰刀菌种、复合群、属的鉴定率分别为16.67%、100.00%、100.00%；其他13株丝状真菌在种、复合群、属的鉴定率均为46.15%。见表2。取检测完靶板上的结晶物接种培养，均未生长。

乙腈-甲酸法鉴定至种、复合群、属的鉴定率分别为45.75%、93.40%、93.40%；175株曲霉种、复合群、属鉴定率分别为44.00%、93.14%、93.14%，其中烟曲霉、构巢曲霉可100.00%鉴定至种，聚多曲霉80.00%鉴定至种，土曲霉可100.00%鉴定至复合群，黄曲霉87.50%鉴定至复合群，黑曲霉84.00%鉴定至复合群； 12株镰刀菌种、复合群、属鉴定率分别为18.18%、100.00%、100.00%；其他13株丝状真菌在种、复合群、属的鉴定率均为92.31%。见表2。

双甲酸涂靶法将1株芽枝状枝孢霉错误鉴定为红色毛癣菌，1株短帚霉错误鉴定为土曲霉复合群，另有17株未获得鉴定结果，占8.02%(17/212)；乙腈-甲酸提取法将2株夏威夷弯孢霉鉴定为夏威夷弯孢霉/穗状弯孢霉(复合群水平正确)，无鉴定结果14株，占6.60%(14/212)。见表3。

表3 基因测序法、双甲酸涂靶法、乙腈-甲酸提取法鉴定结果分析

2.3双甲酸涂靶法与乙腈-甲酸提取法鉴定一致性比较 双甲酸涂靶法、乙腈-甲酸提取法与基因测序的鉴定一致性，在种水平的Kappa值分别为0.022、0.056；在复合群、属水平的Kappa值分别为0.421、0.536。双甲酸涂靶法与乙腈-甲酸提取法在种水平的Kappa值为0.880，在复合群、属水平的Kappa值均为0.726。

3 讨论

本研究采用双甲酸涂靶法对212株丝状真菌进行质谱鉴定，种、复合群、属鉴定率分别为43.87%、91.04%、91.04，与基因测序结果的鉴定率84.91%、100%、100%比较，Kappa值分别为0.022、0.421、0.421，说明双甲酸涂靶法在种鉴定上与基因测序一致性一般，在复合群、属鉴定上一致性较高，导致种水平鉴定率低的原因与Vitek MS 数据库对某些常见丝状真菌只能鉴定到复合群水平有关。双甲酸涂靶法在种、复合群、属的鉴定率与乙腈-甲酸提取法的45.75%、93.40%、93.40%相近，Kappa值分别为0.880、0.726、0.726，表明2种丝状真菌的前处理方法在种水平具有很好的一致性，在复合群、属水平具有较高的一致性，2种方法对丝状真菌的鉴定能力接近，可考虑应用于临床丝状真菌质谱鉴定的前处理。双甲酸涂靶法对175株曲霉种、复合群、属的鉴定率分别为44.40%、93.71%、93.71%，属鉴定率结果与Becker等[8]报道的93.62%相近，复合群鉴定率与张桂等[9]报道的88.31%相似，但种鉴定率与张桂等[9]报道的64.66%和苍金荣等[1]报道的91.1%存在较大差异。虽然Bruker和Vitek MS 数据库中均包含多种丝状真菌参考图谱，但由于不同系统在菌株鉴定时的判断标准存在差异和部分少见真菌无对应的参考图谱等因素，可能造成上述结果的差异[10]。Vitek MS数据库(IVD v3.0)检测系统对黑曲霉、黄曲霉、土曲霉、部分镰刀菌、毛霉目等仅能鉴定至复合群水平，导致本研究种的鉴定率偏低，故与基因测序在种水平上的鉴定一致性存在较大的差距，但在复合群、属水平上具有较高的鉴定一致性。双甲酸涂靶法对常见曲霉如烟曲霉、聚多曲霉、构巢曲霉具有较高的种鉴定一致率；对烟曲霉鉴定正确率可达98.41%，与Iriart等[11]报道的98.2%相近；黑曲霉复合群鉴定一致率偏低(80.00%)，可能与深色真菌色素可以抑制MALDI-TOF MS中的解吸/电离过程有关[12]。

双甲酸涂靶法前处理到结果检出约需10 min，而且实验过程中使用仪器配套的25%甲酸，降低了甲酸浓度，减少了甲酸用量，使其形成的结晶体更易干燥，降低实验成本，与乙腈-甲酸提取法相比较(耗时约1 h)，优化了实验流程。该方法对于培养基上早期生长的幼龄菌丝体(平均培养时间为3 d)，可以进行快速前处理上机鉴定，操作简单方便；对丝状真菌灭活效果好，减少样本培养及处理过程中可能的实验室污染和生物安全隐患。由于质谱技术本身存在方法学局限性，导致双甲酸涂靶法对于同源性较高菌种出现不能区分的结果。本研究中37株黄曲霉仅能鉴定至黄曲霉/米曲霉，对于该类质谱不能区分且有重要临床意义的菌株，分子测序是鉴定的“金标准”[13]；同时，质谱峰图质量低可导致鉴定错误和无法鉴定现象[14]，本研究将2株丝状真菌鉴定错误，17株(8.02%)丝状真菌无鉴定结果。

综上所述，双甲酸涂靶法在丝状真菌的鉴定能力上与乙腈-甲酸提取法相接近，优化了前处理实验流程，具有简便高效的特点；对丝状真菌灭活效果良好，可考虑应用于临床丝状真菌的质谱鉴定，弥补传统形态学鉴定的不足。