补中助长颗粒对SD鼠GH/IGF-1及OPG/RANK/RANKL的影响

孙凤平，李宁宁，韩雪*

(1.郑州大学附属儿童医院,河南省儿童医院,郑州儿童医院，河南 郑州 450053；2.河南医学高等专科学校，河南 郑州 451191)

矮小症是影响小儿生长发育的重要问题，不仅影响ISS患儿的生活质量和心理健康，甚至对其家庭和社会都会造成一定的负面影响[1-2]。统计显示，我国儿童矮小症发病率约为3.0%，全国4～5岁可治疗的矮小患儿总人数约为700万人。特发性矮小(idiopathic short stature，ISS) 是儿童矮小症最常见病因，约占矮小症的60%～80%[3-4]。课题组前期研究发现，经验方补中助长颗粒不仅可改善ISS患儿脾胃虚弱症状，还能促进患儿生长，提高血清IGF-1水平，但患儿血清生长激素(GH)水平并未明显改变，提示该药促生长机制不同于传统的GHRH/GH/IGF-1轴[5-6]。因此，本研究通过观察补中助长颗粒对15日龄SD大鼠血清GH/IGF-1及OPG/RANK/RANKL系统的影响，探讨其治疗ISS的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

15日龄雄性无特定病原体(SPF)级SD大鼠50只,购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，许可证号：SCXK(鲁)20140007。

1.2 实验药品

补中助长颗粒：由人参10 g，白术10 g，山楂10 g，神曲10 g，木香10 g，陈皮10 g，当归10 g，香附10 g，郁金5 g，酒大黄5 g，炙甘草5g组成(由河南中医药大学加工成膏剂，每1 g含原生药材10 g，批号：170816；赖氨肌醇维生素B12口服液(湖南方盛制药股份有限公司，国药准字H43022116)。

1.3 试剂及试剂盒

Anti-OPG抗体(abcam公司，货号：ab124820)，RANKL抗体(武汉三鹰公司，货号：23408-1-AP)，RANK多克隆抗体(苏州睿赢公司，货号：RLT5881),GH试剂盒(武汉华美生物工程有限公司，货号：CSB-E07342r)，IGF-1试剂盒(武汉华美生物工程有限公司，货号：CSB-E04582r)，OPG试剂盒(武汉华美生物工程有限公司，货号：CSB-E07404r)，RANK试剂盒(武汉华美生物工程有限公司，货号：CSB-EL023968RA)，RANKL试剂盒(武汉华美生物工程有限公司，货号：CSB-E05126r)

1.4 主要仪器

徕卡手动切片机(德国徕卡公司，型号：徕卡RM2235)，奥林巴斯显微镜(奥林巴斯公司，型号：CX31)，酶标仪(美国热电公司，型号：Multiskan FC)，低温离心机(美国Thermo公司，型号：Sorvall Legend Micro 17R)。

1.5 方法

1.5.1 分组及给药方法

15日龄SD小鼠适应性喂养10 d后，采用随机数字法分为正常组、西药组、中药高剂量组、中药中剂量组、中药低剂量组，每组各10只。各组动物喂饲普通饲料的同时，正常组按1 mL/(kg·d)灌服无菌水，西药组按照1 mL/(kg·d)灌服赖氨肌醇维生素B12口服液，中药高剂量组按4 g/(kg·d)(相当于成人等效剂量的4倍，成人按60 kg计)灌服补中助长颗粒(混悬液)，中药中剂量组按2 g/(kg·d)(相当于成人等效剂量的2倍，成人按60 kg计)灌服补中助长颗粒(混悬液)，中药低剂量组按1 g/(kg·d)(相当于成人等效剂量，成人按60 kg计)灌服补中助长颗粒(混悬液)，连续8周。

1.5.2 取材

灌胃8周后处死动物，处死前12 h禁食不禁水，按2 mL/kg体质量腹腔注射8%异戊巴比妥钠麻醉，摘眼球取血，装入采血管中，3 000 r/min离心10 min分离血清，-20℃ 保存；取部分肋软骨，以10%福尔马林固定后，石蜡包埋切片，以备免疫组化检测。

1.6 检测指标及方法

1.6.1 观察指标

血清GH、IGF-1、OPG、RANK、RANKL(酶联免疫吸附法)，肋软骨OPG、RANK、RANKL积分光密度值(免疫组织化学染色法)。

1.6.2 血清GH、IGF-1、OPG、RANK、RANKL检测

第一次孵育：血清GH、IGF-1、OPG、RANK、RANKL样本各40 μL分别与生物素化单克隆特异性抗体形成夹心化合物；第二次孵育：在加入包被链霉亲和素的磁珠微粒后，将以上复合物通过生物素和链霉亲和素的交互作用结合到微粒上。然后将反应液吸入测量池中，通过电磁作用将磁珠吸附在电极表面，未与磁珠结合的物质通过ProCell/proCellM被去除。再给电极加入一定的电压，使复合体化学发光，并通过光电倍增器测量发光强度。通过由2点校准生成的分析仪专有的校准曲线和通过试剂条码提供的主曲线来确定结果。

1.6.3 免疫组织化学染色法检测肋软骨OPG、RANK、RANKL表达

将石蜡切片脱蜡入水，抗原修复，双氧水封闭，加入抗体，用DBA显色剂进行显色反应，HE复染，脱水透明。将染色后的切片置于显微镜高倍镜(×400)下选取3个视野拍片，应用XSP病理图像分析系统分析图像，以免疫组化染色阳性信号累积光密度值作为组织表达目标抗体的定量标准。

1.7 统计方法

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况分析

用药过程中西药组、中药中剂量组各死亡1只，中药高剂量组、中药中剂量组各死亡2只，考虑灌胃操作不当所致。其余大鼠状态良好，毛色光泽，动作灵活，饮食、排便、体重增长正常。

2.2 各组大鼠血清GH、IGF-1水平比较

各组大鼠血清GH水平无显著性差异(P>0.05)，中药中剂量组血清IGF-1水平高于其他各组，和其他组比较有统计学意义(P<0.05)，正常组、西药组、中药高剂量组、中药低剂量组IGF-1水平比较无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠GH、IGF-1水平比较

2.3 各组大鼠血清OPG、RANK、RANKL水平比较

西药组血清OPG水平显著高于正常组、中药低剂量组(P<0.05)，和中药中剂量组、中药高剂量组血清OPG水平比较无显著性差异(P>0.05)，中药中剂量组血清OPG水平明显高于正常组、中药高剂量组、中药低剂量组(P<0.05或P<0.01)，正常组、中药高剂量组、中药低剂量组血清OPG水平比较无统计学意义(P>0.05)。各组大鼠血清RANK水平比较无显著性差异(P>0.05)。中药中剂量组血清RANKL水平显著高于其他各组(P<0.05)，正常组、西药组、中药高剂量组、中药低剂量组血清RANKL水平无显著性差异(P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠血清OPG、RANK、RANKL水平比较

2.4 各组大鼠肋软骨OPG、RANK、RANKL积分光密度值比较

中药中剂量组肋软骨OPG积分光密度值显著高于正常组、中药高剂量组、中药低剂量组(P<0.05)，正常组、西药组、中药高剂量组、中药低剂量组肋软骨OPG积分光密度值无显著性差异(P>0.05)，各组大鼠肋软骨RANK、RANKL积分光密度值比较无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组大鼠肋软骨OPG、RANK、RANKL积分光密度值较

3 讨论

ISS的发病机制目前尚不明确，相关研究主要集中在遗传因素、GHRH/GH/IFG-1轴基因突变[7-10]、营养缺乏[11-12]等方面。重组人生长激素(rhGH)是治疗ISS的首选药物，但该药价格高昂，临床疗效个体差异性较大，加之其副作用所带来的医疗风险[13-14]，在临床上尚未达成一致。和rhGH相比，中药具有价格低廉、使用灵活、无毒副作用等优点，因此，中医药干预ISS当有很好的前景。

本研究所用经验方补中助长颗粒，由《小儿药证直诀》异功散、《医宗金鉴》颠倒木金散合香附、鸡内金、神曲、山楂等组成，具有健脾益气、消食和胃之功，全方补脾而不壅滞，和胃而不耗气，味温而不助热，且无毒副作用，适合ISS患儿长期服用[5]。课题组前期研究表明，补中助长颗粒可增加ISS患儿身高增长速度和预测成年身高，提高患儿血清IGF-1水平，但治疗前后ISS患儿体内GH水平无明显变化[5-6]，提示中药干预ISS生长不是通过传统的GH/IGFs通路，而通过干预IGF-1和软骨细胞增殖、分化和成骨可能是其促进生长的重要机制。

OPG/RANK/RANKL系统属于肿瘤坏死因子超家族成员，是目前发现的最重要的骨组织代谢信号调节系统，对生长板软骨细胞的增殖、分化和成骨起着重要的作用。骨保护素(osteoprotegerin，OPG)属可溶性的分泌型糖蛋白，广泛存在于人体骨骼、心、肺、肝等多种组织中，氨基酸全长为401个残基，包含21个氨基酸的信号肽和380个氨基酸成熟肽[15]。NF-ΚB 受体活化因子(receptor activator of NF-κB，RANK)也属于TNF受体家族成员，属I型跨膜蛋白，是RANKL的信号受体。人的RANK蛋白是由616个氨基酸的组成的同源三聚体，其胞外结构由208个氨基酸组成，包含4个富含半胱氨酸的重复序列，为N-末端，主要功能是与细胞核因子κB受体活化因子配体(receptoractivator of NF-κB ligand，RANKL)的C-端结合并产生传递信号[16]。RANKL是由371个氨基酸组成的一种Ⅱ型跨膜蛋白，在成骨细胞、软骨细胞和骨髓干细胞及T、B淋巴细胞均有广泛地表达[17]。OPG主要通过与RANK竞争性结合RANKL，阻碍RANKL与RANK的结合，从而拮抗RANK所介导的生物学效应，降低破骨细胞分化，增加BMD[18]。有人报道通过调整RANKLmRNA和OPGmRNA的表达比例，可使软骨细胞量上调，下调RANKLmRNA可抑制破骨细胞的成熟、活化及骨吸收活性[19]。目前ISS患儿GH/IGF-1和OPG/RANK/RANKL系统的相关性研究较少，且尚无定论。研究表明，rhIGF-1可能通过影响OPG、RANKL而调节成骨细胞、破骨细胞的平衡，促进骨重建，从而促进大鼠成骨细胞的增殖、分化[20]。也有人将SD大鼠行坐骨神经切除术后将其分为实验组和对照组，实验组大鼠注射IGF-1，对照组注射生理盐，发现实验组大鼠BMD增强，OPG水平增高，RANKL水平下降[21]。

本研究中，各组大鼠血清GH水平无显著性差异(P>0.05)，中药中剂量组血清IGF-1水平显著高于其他各组(P<0.05)，这和课题组前期临床研究一致[5-6]。中药中剂量组血清OPG水平及肋软骨OPG积分光密度值明显高于正常组、中药高剂量组、中药低剂量组(P<0.05或P<0.01)，提示促进机体OPG表达是补中助长颗粒促进身高增长的重要机制。至于补中助长颗粒是通过刺激机体IGF-1表达以介导OPG表达，还是直接促进OPG表达，或二者兼而有之，有待于进一步研究。中药中剂量组RANKL水平明显高于其他各组(P<0.05)，这和以往报道不一致[20-21]，加之各组大鼠肋软骨RANKL积分光密度值比较无显著性差异(P>0.05)，由此推测，由于OPG/RANK/RANKL系统处于动态平衡状态，当外界因素刺激导致机体OPG表达增强的同时，RANKL表达可能也会相应增强。在用药过程中，各组大鼠血清及肋软骨RANK水平无明显变化，提示中药补中助长颗粒在促进OPG表达的同时，抑制了RANK的表达。

综上，本研究结果表明补中助长颗粒促进IGF、OPG的表达是其促进身高增长的重要机制。课题组将进一步观察补中助长颗粒作用下软骨细胞的形态学变化及其与OPG/RANK/RANKL系统的相关性。