养阴活血解毒方对实验大鼠肝组织相关标志性蛋白表达的影响

梁小文，张钰斌，马超，谢鸿恩，陈啟红，刘中景

(粤北第二人民医院感染科，广东 韶关 512028)

肝硬化及其并发症是当下临床医生所面对的主要肝病人群，也是临床治疗难题，现代医学尚缺乏有效治疗药物，西药抗病毒治疗只能在一定程度上控制病情，仍然不能阻止肝硬化的反复发病甚至逆转肝硬化[1]。近年来，大量的临床与基础研究工作业已证实，中医中药在抗肝硬化方面有着明显治疗优势[2],其机理主要表现在拮抗肝星状细胞(HSC)的活化；抑制活化的HSC细胞增殖与胶原生成；调节肝组织基质金属蛋白酶活性，逆转肝窦毛细血管化等等[3]。一致认为“扶正化瘀”为中医治疗肝硬化的基本原则[4]，而滋养肝肾活血化瘀中药处方具有明显的抗肝纤维化效果[5]。

我们在长期临床实践的基础上总结发现，肝肾阴虚、瘀血湿热是肝硬化多见中医证型之一，滋养肝肾、活血解毒治疗可以取得较好的临床效果，本研究在长期临床实践的基础上观察养阴活血解毒方对实验大鼠肝组织相关标志性蛋白表达的影响，探讨其抗肝纤维化的作用机理。

1 实验材料

1.1 动物

雄性SD大鼠共60只，体质量150～200 g，由青岛市疾病控制中心动物实验中心提供(合格证号：sexk20180020)。

1.2 药物

中药：由粤北第二人民医院中药房提供，资格中药师鉴定真伪。养阴活血解毒方：柴胡15 g，香附12 g，川芎12 g，丹参15 g，桃仁12 g，红花12 g，白芍15 g，熟地黄15 g，麦冬15 g，枸杞15 g，茵陈15 g，白花蛇舌草15 g。以上药物先冷水浸泡约1 h，武火煮沸后改用文火煎至40 min，二次复煎去渣取汁，合和混均并水浴浓缩至浓度为0.75 kg/L，制成水煎夜放置冰箱备用。

西药：秋水仙碱(浙江华海药业股份有限公司，国药准字H20030016)，粤北第二人民医院西药房提供。换算成大鼠用药剂量，每次用药剂量为成人每日用药剂量(1 mg/60 kg)的20倍，即0.25 mg/kg，蒸馏水调制，药液浓度为0.025 g/L，冰箱贮备。

2 实验方法

2.1 造模

按照相关文献[6]，CCl4与花生油二者均购于广州市光明化学股份有限公司。两者以4∶6比例配成40%制剂，除空白对照组外，其余各组大鼠均执行CCl4制剂腹腔注射。首次以0.5 mL/100 g体质量剂量，后继续以0.3 mL/100 g体质量剂量注射，每周2次，约第4周末大鼠中期肝纤维化形成，继续维持注射至第12周。实验结束后以戊巴比妥钠0.5 g加生理盐水腹腔麻醉注射，打开腹腔，摘取肝组织-20 ℃保存，做相关指标检测。

2.2 给药及分组

60只雄性SD大鼠随机分为4组，即空白组、模型组、西药组和中药组，每组15只。于造模后第4周末大鼠中期肝纤维化形成[6]开始灌胃给药。空白组和模型组以生理盐水2mL每天2次；西药组以秋水仙碱制剂按大鼠0.1 mg/kg体质量剂量给药；中药组以中药制剂2 mL每天2次给药。共给药8周。

2.3 检测方法

肝组织羟脯氨酸含量测定采用比色法，参考相关文献[7]。主要试剂：羟脯氨酸标准液，枸橼酸钠缓冲液，二甲氨基苯甲醛液，Tris缓冲液等(武汉博欧特生物科技有限公司提供)；胰蛋白酶(广州辉骏生物科技有限公司提供)。取10 g肝组织，加30 mLTris缓冲液冰浴500 r/min匀浆，加入2.5%胰蛋白酶2 mL 37 ℃水浴20 min，低温离心固液分离。绘制标准曲线，横坐标为羟脯氨酸浓度，纵坐标为吸光度，样品于60 ℃水浴20 min冷却后在560 nm处测吸光度。

肝组织α-SMA、Smad3检测采用免疫组化法(SP法)。取大鼠肝组织约1 cm×1 cm甲醛液固定，石蜡包埋切片，免疫组化染色。切片经梯度酒精脱水，中性树胶封固。采用HPIAS-2000型图象分析软件进行定量分析，每张切片选取10个视野测定其阳性细胞的灰度值与染色阳性面积。主要试剂：鼠抗人α-SMA购于深圳子科生物科技有限公司；羊抗大鼠Smad3购于上海樊克生物科技有限公司；免疫组化S-P试剂盒及其DAB显色剂购于武汉博欧特生物科技有限公司；免疫PS试剂盒购于武汉博欧特生物科技有限公司。

2.4 统计学分析

3 结果

3.1 对大鼠肝组织Hyp表达的影响

见表1。与空白大鼠组比较，造模后大鼠肝组织Hyp含量表达明显，差异有显著性(P<0.01)。各组给药后其Hyp的表达情况:中药组Hyp含量明显下降,与模型组比较P<0.05、与西药组比较P>0.05无统计学意义；而西药组与模型组比较P<0.05也有统计学意义。

表1 大鼠肝组织Hyp含量表达情况

3.2 对大鼠肝组织α-SMA、Smad3表达的影响

见表2、表3。表2为各组肝组织α-SMA、Smad3染色灰度值(表达产物)情况，灰度值越高，表达产物越少；灰度值越低，表达产物越多。

由表2可见，空白组灰度值与模型组比较有显著性差异(P<0.01，P<0.01)；西药组与模型组比较其α-SMA、Smad3灰度值也分别有显著性差异(P<0.01，P<0.05)；而中药组在与模型组比较差异显著(P<0.01，P<0.01)，即与西药组比较也有统计学意义P<0.05，P<0.01)。

表2 各组肝组织α-SMA、Smad3灰度值比较

表3为各组肝组织α-SMA、Smad3染色阳性面积比较情况。由表3可见，空白组与模型组比较有显著性差异；西药组与模型组比较也分别有显著性差异(P<0.01，P<0.01)；中药组比模型组其α-SMA、Smad3染色面积差异显著(P<0.01，P<0.01)，即与西药组比较其Smad3染色面积也有显著性差异(P<0.01)。

表3 各组肝组织α-SMA、Smad3染色阳性面积

4 讨论

肝纤维化的共同病理特征是肝细胞外基质尤其是胶原的过量沉积[8]。其发生发展过程，先是由于肝细胞损伤，进一步激活肝星状细胞(HSE)，而后者又导致肝细胞外基质(ECM)的不断沉积，从而导致肝纤维化的发生[9-10]。

α-SMA是肝组织中的一种特有标志性蛋白，是肝星状细胞(HSE)活化、增殖、过度分泌的显著指标，与肝纤维化程度存在正相关系[11]。而HSC的活化、细胞外基质(ECM)的合成以及肝纤维化的形成发展尚必须有Smad3的参与[12]。在肝纤维化形成过程中。Smad3作为肝细胞内主要信号传导介质，通过细胞浆至细胞核之间的信号传递来调控目的基因的表达，实现活化HSC、促进ESM合成等效应[13]。羟脯氨酸(Hyp)是一种非必需氨基酸，是构成组织内胶原蛋白的主要成分之一，测定其在胶原组织中的含量是衡量胶原代谢的重要指标[14]，肝纤维化时由于ECM内胶原组织明显增加导致Hyp含量的升高，因此直接检测肝组织中的Hyp含量可反映出肝纤维化的程度[15]。

有研究工作提示，中医中药抗肝纤维化的作用机理可能通过以下途径实现：(1)抑制肝星状细胞(HSC)激活、促进其凋亡[16]；(2)阻断由于ESC的自分泌引起的递链反应，从而阻止肝纤维化的进展[17]；(3)下调 Smad3、α-SMA蛋 白表达 ，进而抑制肝星状细胞活化，达到阻止肝纤维化进展的目的[18]。

扶正祛邪是中医对肝纤维化的根本治疗原则[19]，而肝肾阴虚、瘀血阻滞则是“指南”中中医主要辨证分型之一[20]。肝为刚脏，体阴而用阳，我们在长期临床工作中体会到，肝纤维化的发生发展与肝肾阴虚有着密切关系，这和某研究工作相吻合[21]，即肝肾阴虚为本，瘀血湿毒是标。养阴活血解毒方以当归、熟地黄、白芍、枸杞滋养肝肾；桃仁、红花、川芎、丹参活血化瘀；柴胡、香附疏肝解郁导滞；茵陈、白花蛇舌草清解肝胆湿毒，临床上可以取得很好的治疗效果。

本研究工作结果显示，中药组对模型大鼠肝组织Hyp的表达有明显抑制作用，与模型组比较P<0.05；西药组与模型组比较也有显著性差异(P<0.05)；中药组与西药组之间比较无统计学意义。

对肝组织α-SMA、Smad3表达的影响，中药组与模型组比较，均有显著性差异(P<0.01)，即与西药组比较，也分别具有显著性差异(P<0.05)。

本研究结果显示,养阴活血解毒方可明显抑制实验大鼠肝组织Hyp以及α-SMA、Smad3的表达，从而实现对肝纤维化的治疗作用。