养阴解毒方对人肺腺癌耐药细胞PC9/R信号蛋白AKT磷酸化及PTEN表达影响研究

张婷，李昂，孙建立

(1.上海中医药大学附属龙华医院 肿瘤六科，上海 200030；2.复旦大学附属华山医院 中医科, 上海 264000；3.武汉市汉南区人民医院 中医科，武汉 430090)

靶向治疗已成为肺癌的主要治疗方法，对于EGFR基因敏感突变的患者效率达70%，且具有耐受性好、毒副作用小、生活质量高等优点，但是多项研究表明靶向治疗NSCLC的中位无疾病进展生存期仅有10个月左右[1-4]，如何延缓耐药成为肺癌靶向治疗研究的热点和难点。

“证”是辨证论治的核心，我们以国医大师刘嘉湘“扶正治癌”理论为指导[5]，通过对中医辨证结合吉非替尼治疗非小细胞肺癌后中医证侯变化的特点进行观察分析，结果发现吉非替尼治疗后肺癌患者中医证侯有独特的变化规律，在国内首先提出靶向治疗肺癌后中医病机特点以“热毒伤阴，余毒未净”为主[6]，拟养阴解毒方并进一步探讨了养阴解毒方对吉非替尼增敏的作用和机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞

吉非替尼耐药细胞株PC9/R细胞由上海同济大学附属肺科医院肿瘤研究所周彩存教授惠赠。

1.1.2 动物

Sprague-Dawley大鼠，10～11周龄，SPF级，雄性，体质量(350±50)g，60只，由上海新莱克实验动物有限责任公司[SYXK(沪)2010-0095]提供，饲养于上海中医药大学附属龙华医院SPF级动物房，室温25 ℃，湿度70%，自由进食、饮水。实验经大学动物实验伦理委员会批准。

1.1.3 药物及试剂

养阴解毒方(YYJD)由北沙参、天门冬、夏枯草、石上柏、山慈菇等组成，加水10倍量浸泡40 min，煎煮，沸后计时，煎煮1 h，过滤，药渣加水10倍量，煎煮1 h，滤过，合并两煎滤液，浓缩至一定稠度，真空干燥(60 ℃)，得浸膏粉70.7 g。每g干膏粉相当于1.697 g生药。

吉非替尼(G)：由英国AstraZeneca公司生产，上海阿斯利康公司提供；AnnexinV凋亡检测试剂盒购于BD公司；P-Akt、Akt抗体及GAPDH购于CST公司；PTEN抗体购于Abcam公司；CCK-8试剂盒、羊抗兔HRP标记二抗及羊抗鼠HRP标记二抗购于碧云天生物有限公司。

1.1.4 养阴解毒方含药血清的制备

将SD大鼠60只随机分为4组，每组15只。中药分三个剂量组，高、中、低剂量分别为生药35 g/(kg·d)、17.5 g/(kg·d)和8.75 g/(kg·d)，空白对照组以等体积生理盐水，灌胃前禁食12 h。每日2次灌胃，共灌胃3 d，末次灌胃后1～2 h行腹主动脉取血，采血后离心(2 000 r/min，10 min)，分离血清，各组混合成一无菌离心管，56 ℃水浴箱灭活抗体30 min，采用0.22 μm滤器除菌后分装，于-80 ℃冰箱保存备用。

1.2 方法

1.2.1 细胞增殖抑制检测

采用CCK-8法，抑制率按下列公式计算：抑制率(%)=[ (空白组OD值-实验组OD值)/(空白组OD值-对照组OD值)]×100%，绘制量效曲线，计算出半数抑制浓度(IC50)值，实验重复3次。体外两药联合应用时，用金正均法(即金氏公式法)求协同指数(Q值)，再判断拮抗、相加、协同效果。

1.2.2 细胞凋亡和周期的检测

将细胞接种于6孔板中，实验药物处理72 h，对细胞进行胰蛋白酶消化，用70%乙醇固定4 h，孵育30 min后用碘化丙啶(400 μL)染色。立即用流式细胞术分析细胞周期。使用Annexin V凋亡细胞检测试剂盒检测细胞凋亡。用流式细胞仪进行细胞DNA含量的测定，确定细胞在各细胞周期所占比例。每个实验重复3次。

1.2.3 Western blot检测AKT、p-AKT及PTEN的表达

将需要抽提的蛋白的细胞从培养箱中取出，吸去培液，适量预冷的1×PBS洗涤2次，吸去PBS，加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解液，4 ℃充分裂解细胞，将细胞刮入1.5 mL EP管中，95 ℃以上加热10 min，12 000 r/min离心10 min，取上清，进行蛋白质定量，根据目的蛋白的分子量选择不同的凝胶浓度，以GAPDH作为内参基因，同样进行以上操作。以p-AKT以及PTEN与GAPDH条带吸光度比值作为其蛋白表达水平。

1.3 统计方法

实验数据用均数±标准差(Mean±SD)表示，并采用SPSS 18.0统计分析软件进行数理统计分析，对各组实验数据先用Kolmogrov-Smitnov法和Shapiro-Wlik法进行正态性检验，再用Levene法进行方差齐性分析，若符合正态分布和方差齐性，则采用一般线性模型进行两因素两水平(2×2)析因设计的方差分析，多重组间两两比较采用LSD-t检验。若经数据转换后方差仍然不齐，则行Kruskal-Wallis法；若数据不符合正态分布，则进行非参数多重秩和检验，多重组间两两比较用Nemenyi法，P<0.05表示有统计学意义。

2 结果

2.1 养阴解毒方及其结合吉非替尼对人肺腺癌获得性耐药株PC9/R细胞增殖抑制作用

高、中、低剂量养阴解毒方组(YYJD组)根据含药血清浓度分5组，与单药吉非替尼组(G组)(5 μmol/L)作对照，结果见表1，通过计算养阴解毒方的IC50，选择高剂量养阴解毒方含药血清浓度为8%，中剂量为8.8%，低剂量为41.7%，与不同浓度吉非替尼联合对PC9/R的作用，结果见表2。均为培养箱培养48 h后检测。

表1 养阴解毒方对耐药人肺腺癌PC9/R的抑制率

表2 养阴解毒方联合吉非替尼对耐药人肺腺癌PC9/R的抑制率

研究结果显示养阴解毒方较吉非替尼而言有较好的抑制耐药细胞的作用，并有较好的量效关系。吉非替尼联合养阴解毒方各剂量组均能在吉非替尼较低浓度时增强抑制细胞生长的作用，养阴解毒方中、低剂量联合吉非替尼干预组在低浓度均比吉非替尼单药组能抑制细胞增殖。以金正均法计算药物交互作用，吉非替尼联合养阴解毒方低剂量各组Q值均>0.85，具有效应相加及协同作用，尤其为吉非替尼低浓度组加养阴解毒方低剂量组协同作用明显；吉非替尼最低浓度药物敏感度从5.506%提高到57.29%,结果具有统计学意义(P<0.01)。

2.2 养阴解毒方对耐药人肺腺癌PC9/R细胞凋亡的影响

吉非替尼(5 μmol/L)和养阴解毒方(低剂量组含药血清浓度为40%)分别作用于PC9/R细胞，流式细胞术检测各组细胞凋亡比例结果见表3。养阴解毒方可诱导PC9/R细胞凋亡，抑制正常细胞增殖并增加早期凋亡细胞，均有显著统计学意义(P<0.01)；两药联用组较吉非替尼单药组可明显提高吉非替尼诱导PC9/R细胞凋亡的能力，有显著统计学意义(P<0.01)；且两药联用组较养阴解毒方组可促使细胞凋亡速度加快，有统计学意义(P<0.05)。上述结果表明养阴解毒方可诱导人肺腺癌获得性吉非替尼耐药PC9/R细胞凋亡，抑制正常细胞增殖并增加早期凋亡细胞，两药联用组较吉非替尼单药组可明显提高吉非替尼诱导PC9/R细胞凋亡的能力。

表3 养阴解毒方含药血清及其结合吉非替尼诱导PC9/R细胞凋亡的作用

2.3 养阴解毒方对耐药人肺腺癌PC9/R细胞周期的影响

吉非替尼和养阴解毒方分别作用于PC9/R细胞，经流式细胞术检测各组别细胞周期情况如表4。养阴解毒方组及联合用药组干预后人肺腺癌PC9/R细胞S期(DNA复制期)均较吉非替尼单药细胞周期缩短，有明显差异(P<0.01)；G0-G1期(DNA合成前间期)养阴解毒方组及联合用药组均能较吉非替尼单药明显使细胞停滞在此期，有显著统计学意义(P<0.01)；而G2-M期(DNA合成后间期)吉非替尼单药组与养阴解毒方组有明显细胞比例增高，有显著统计学意义(P<0.01)，联合用药组较吉非替尼单药组细胞差异无明显著统计学意义(P>0.05)。以上实验结果表明养阴解毒方可有效抑制耐药细胞的DNA合成活性，养阴解毒方可使耐药细胞停滞在DNA合成前、后间期，联合用药可使耐药细胞停滞在DNA合成前间期。

表4 养阴解毒方及其结合吉非替尼对耐药人肺腺癌PC9/R细胞周期的影响

2.4 养阴解毒方对PC9及PC9/R细胞P-Akt和P-Akt表达的影响

各组细胞经干预48h后，收集细胞，Western Blot检测各组细胞AKT通路活化表达水平，60KD处出现p-AKT(Thr308)及p-AKT(Ser473)的特异性显色带，结果如表5，图1。人肺腺癌吉非替尼耐药PC9/R细胞株在吉非替尼干预下AKT两主要活化位点表达均明显超过人肺腺癌吉非替尼敏感细胞株PC9细胞株，有统计学意义(P均<0.05)；养阴解毒方组与联合用药组均比单药吉非替尼单药干预组能加强抑制PC9/R的p-AKT活化位点Thr308的磷酸化，有统计学意义(P均<0.05)，同样也能加强抑制p-AKT活化位点Ser473的磷酸化，有统计学意义(P均<0.05)。从表及图中亦可见纵向比较，在人肺腺癌吉非替尼敏感PC9细胞株及其耐药亚株中，P-AKT活化位点Ser473的活化程度均要比Thr308高。

表5 养阴解毒方及其结合吉非替尼对PC9及PC9/R的P-AKT表达的影响

注:每组第一柱结合位点为Thr308,第二柱结合位点为Ser473

2.5 养阴解毒方及其结合吉非替尼对PC9及PC9/R细胞PTEN表达的影响

各组细胞经干预48h后，收集细胞，Western Blot检测各组细胞PTEN表达水平，54KD处出现PTEN的特异性显色带，结果如表6，图2。人肺腺癌吉非替尼耐药细胞株PC9/R的PTEN表达显著低于敏感细胞株PC9，有统计学意义(P<0.01)；联合用药组耐药株PC9/R的PTEN表达显著高于其余各组，有统计学意义(P<0.01)；其中养阴解毒方干预的耐药细胞株PC9/R与吉非替尼干预的敏感细胞株PC9无明显差异(P>0.05)。

表6 养阴解毒方及其结合吉非替尼对PC9及PC9/R的PTEN表达的影响

图2 各干预组PTEN表达的检测

3 讨论

随着靶向治疗在肺癌中的广泛应用，中医药结合靶向治疗的研究也越来越多，如何运用中药延缓吉非替尼吉非替尼的耐药成为研究的方向之一。本课题组前期研究[6-7]发现经吉非替尼治疗后肺癌患者有从气虚向气阴两虚、气阴两虚向阴虚转化的趋势，显示吉非替尼治疗后肺癌患者中医证侯有独特的变化规律，在国内首先提出吉非替尼治疗肺癌后中医病机特点为以“热毒伤阴，余毒未净”为主，论治以养阴解毒法为主。结合国医大师刘嘉湘对肺癌靶向患者中药治疗的经验，选择北沙参、天门冬、夏枯草、石上柏、山慈菇等中药组成养阴解毒方，进行系列的临床观察和实验研究[8]。本课题选择吉非替尼耐药的人肺腺癌PC9/R细胞株，研究养阴解毒方及其结合吉非替尼的作用和机制，结果显示养阴解毒方对耐药人肺腺癌细胞株PC9/R细胞的增殖有抑制作用，并显示一定的量效关系，养阴解毒方高、中、低剂量组均能够在吉非替尼低剂量应用时增加人肺腺癌PC9/R细胞株对吉非替尼的敏感性；尤以低剂量组效果更优，两药联合使用有明显的增效作用。养阴解毒方单药以及联合用药组均能抑制人肺腺癌细胞PC9的DNA复制；吉非替尼诱导细胞停滞在G0-G1期，而养阴解毒方组及联合用药组诱导细胞停滞在G2-M期，证实养阴解毒方所诱导细胞凋亡机制与吉非替尼并不完全相同。养阴解毒方以及联合用药组均可抑制人肺腺癌获得性耐药细胞PC9/R的增殖活性(DNA复制期细胞减少)，使细胞停滞在G0-G1期；吉非替尼单药组DNA复制期细胞活跃，G2-M期细胞数较其余各组增多。证实养阴解毒方及吉非替尼对原代细胞及耐药细胞诱导凋亡机制有差异，养阴解毒方及联合用药组对耐药细胞株PC/R有明显的抑制作用，且与其在原代细胞PC9诱导凋亡的机制并不完全相同。

研究表明EGFR-TKI的耐药机制十分复杂[9]，主要为EGFR基因突变或靶点缺失，避开EGFR通路的其他TK受体活化，胞内EGFR下游信号蛋白非依赖性或组成性活化。其中，PI3K/Akt信号通路在EGFR-TKI耐药中扮演了重要角色，而PTEN可调节PI3K/Akt通路，与多种肿瘤的转移有关。PTEN是一个具有双特异磷酸酶活性的抑癌因子[10-11]，是PI3K/Akt信号级联通路的主要负调节蛋白，PTEN功能的缺失导致Akt通路的过度活化，在EGFR抑制剂耐药过程中起着重要的作用，外源性PTEN基因对人肺癌细胞株SPC-A-1增殖凋亡及侵袭有明显的抑制作用[12]。

本实验研究结果显示吉非替尼获得性耐药后，PC9/R表现出了磷酸化AKT的表达上升，可能与PI3K/AKT信号通路被旁路激活有关，而敏感细胞PC9在此通路仍被抑制。并从中可见由于Ser473结合位点磷酸化的表达大于Thr308的磷酸化表达，可能为主要的AKT活化的因素，而养阴解毒方及两药联合可以有效抑制从Ser473位点激活AKT磷酸化的表达，养阴解毒方可通过干扰AKT的磷酸化逆转吉非替尼的耐药。

耐药细胞株PC9/R的PTEN表达低下，养阴解毒方联合用药显示出其显著的促进抑癌基因PTEN表达的能力，这可能与养阴解毒方可对Ser380、Thr382、Thr383位点磷酸化的激活有关。养阴解毒方单药仍可显示出其纠正抑癌基因PTEN低表达的作用，在耐药细胞适应浓度下可提高其抑癌基因的表达至吉非替尼敏感株PC9的同等水平。

综上所述，养阴解毒方可抑制重要耐药发生信号通路关键蛋白AKT在Thr308与Ser473位点的活化，可调节耐药细胞株PC9/R的PTEN的表达恢复到非耐药细胞表达水平；两药联用可显著上调PTEN的表达，抑制PI3K/AKT通路活化的信号，从而起到抑制肿瘤生长、逆转耐药的双重作用，为进一步开展养阴解毒方的临床研究提供科学的实验依据。