急性氨氮胁迫对大口黑鲈幼鱼ACP、CAT 和MDA 的影响

(国家海洋设施养殖工程技术研究中心，浙江舟山 316022)

氨氮是水生动物蛋白质代谢的最终产物[1]，也是水产动物养殖水环境中的重要污染物之一。高密度集约化养殖水体中的氨氮主要来自两个方面，一方面是养殖动物的排泄物，养殖者为追求经济效益而造成的过量投喂、管理不科学等问题，增加了养殖动物的代谢产物氨氮的排泄量，另一方面是含氮丰富未被摄食的残饵的分解，如不及时换水会引起水体中氨氮的积累。水体中氨氮一般以非离子氨(NH3)和离子氨(NH4+)形式存在[2]，其中对水生生物产生毒害作用的主要是NH3，能引起养殖动物摄食降低、生长缓慢、免疫力差、运动表现不正常等现象[3-6]。

大口黑鲈Micropterus salmoides 俗称加州鲈鱼，是从北美洲引进的一种优良淡水养殖品种，具有生长速度快、耐受性强、肉质美味、市场需求大、售卖价格高等优点。国内外关于氨氮胁迫对水生动物影响的研究已有大量报道[7-9]，但有关氨氮胁迫对大口黑鲈影响的研究尚未见报道，本实验通过对大口黑鲈进行急性氨氮胁迫，研究了ACP、CAT 酶活性的应激响应及MDA 含量的变化，为大口黑鲈的健康养殖、病害预防提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验水源为充分曝气过的自来水,水质条件为水温21 ℃、溶解氧8.0 mg·L-1、pH 7.9，用10 g·L-1的分析纯NH4Cl 母液配制相应氨氮浓度的实验用水，现用现配。实验用鱼于2019 年2 月购自浙江鸿利饲料苗种厂，运回后放于若干鱼缸(62 cm×47 cm×47 cm)中暂养3 d，暂养期间停食不投饵，每天全部换水1 次，更换水质条件相同的水，持续不断充氧，有死亡个体及时捞出并按时清污。从中选取规格为体质量(19.70±1.98) g、体长(10.5±1.1) cm 的健康个体为实验对象。

1.2 实验设计

实验前先通过预实验得出氨氮胁迫下大口黑鲈幼鱼24 h 未见死亡的最大胁迫浓度和全部死亡的最小胁迫浓度，然后在该浓度范围内按照等对数梯度设计确定1 个对照组和6 个氨氮浓度组进行胁迫。统计出各个时间点的死亡率，使用SPSS 24.0 软件的Probit 回归分析计算出96 h LC50。最终通过预实验得出本实验所使用的大口黑鲈幼鱼96 h LC50为63.34 mg/L。

以此为依据，设置氨氮浓度梯度为30%、45%和60%96 h LC50，即对照和低(19 mg·L-1)、中(28.5 mg·L-1)、高浓度组(38 mg·L-1) 4 个氨氮浓度组，每个浓度组设置3 个平行，每平行放置30 尾鱼，进行急性氨氮胁迫实验。实验过程中的日常管理同暂养期一致，各浓度组水质参数见表1。

表1 各组实验期间水质参数Tab.1 Water quality parameters during the experimental period

分别于胁迫后第0、6、12、24、48、72 和96 h 在每个浓度组中随机取样。每次取3 尾鱼用MS-222 麻醉后解剖，迅速取出鳃、肝、肠、肾和脑置于-80 ℃冰箱保存。不同组织的ACP、CAT 活性及MDA 含量的检测均采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒和检测方法。

1.3 实验数据处理

ACP、CAT 酶活及MDA 含量的检测数据以x¯±SD 表示，利用Excel 进行数据整理,使用SPSS 24.0 软件进行单因素方差分析和Duncan 检验法统计分析，设P＜0.05 为差异显著。

2 结果与分析

2.1 氨氮胁迫对大口黑鲈ACP 活性的变化

不同氨氮浓度胁迫96 h 后，大口黑鲈幼鱼的鳃、肝、肠、肾和脑中ACP 活性变化见图1。随着胁迫时间的延长，不同组织中各浓度组ACP 活性均呈现先上升后下降的变化趋势，96 h 时中、高浓度组均显著高于对照组(P＜0.05)，低浓度组有较明显的恢复趋势。应激处理前各组织中ACP 活性肾＞肝＞肠＞鳃＞脑。肝、肠和脑中的ACP 活性6 h 内快速上升，氨氮应激反应迅速。鳃、肾6 h 内无明显变化，6 h 后开始迅速上升。肠中ACP 活性24 h 达到最大值，且不同处理组间差异显著(P＜0.05)，24 h 后逐渐下降。其他组织中ACP 活性均在48 h 达到最大值，且不同处理组间差异显著(P＜0.05)，并与氨氮浓度呈显著正相关(P＜0.05)。48 h 开始不断下降，至96 h 时未恢复正常水平。图中不同的字母表示同一时间段处理组间差异显著(P＜0.05)。

图1 急性氨氮胁迫对大口黑鲈幼鱼不同组织ACP 活性的影响Fig.1 Effects of acute ammonia-N stress on ACP activity in different tissues of juvenile M.salmoides

2.2 氨氮胁迫对大口黑鲈CAT 活性的变化

不同氨氮浓度胁迫大口黑鲈幼鱼不同组织CAT 活性的变化见图2。随着胁迫时间的延长，不同组织中各浓度组CAT 活性总体上呈现先上升后下降的变化趋势，96 h 时高浓度组均显著低于对照组(P＜0.05)，低浓度组有较明显的恢复趋势。应激处理前各组织中CAT 活性肝＞肠＞肾＞脑＞鳃。除肠外其他组织中的CAT 活性6 h 内快速上升，均在6 h 时即达到最大值，且不同处理组间差异显著(P＜0.05)，并与氨氮浓度呈显著正相关(P＜0.05)。6～12 h 快速下降至低于对照组，12 h 后下降趋势减缓。其中，鳃、肝和脑CAT 活性72～96 h 缓慢上升，有明显恢复正常水平的趋势；肠中CAT 活性呈现下降-上升-下降的变化趋势，6 h 内快速下降，6～12 h 又快速上升至最大值，12 h 后逐渐下降，且不同处理组间差异显著(P＜0.05)，96 h 时各浓度组显著低于对照组(P＜0.05)，但低浓度组有较明显的恢复趋势。图中不同的字母表示同一时间段处理组间差异显著(P＜0.05)。

图2 急性氨氮胁迫对大口黑鲈幼鱼不同组织CAT 活性的影响Fig.2 Effects of acute ammonia-N stress on CAT activity in different tissues of juvenile M.salmoides

2.3 氨氮胁迫对大口黑鲈MDA 含量的变化

氨氮胁迫对大口黑鲈幼鱼不同组织MDA 含量的影响变化见图3。应激处理前各组织中MDA 含量肾＞鳃＞肠＞脑＞肝。随着胁迫时间的延长，不同组织中各浓度组MDA 含量均呈现先上升后下降的变化趋势，鳃、肝、肠、脑中MDA 含量均在12 h 时达到最大值，肾中MDA 含量在48 h 达到最大值，且不同处理组间差异显著(P＜0.05)，并与氨氮胁迫浓度呈显著正相关(P＜0.05)。96 h 时各组织中MDA 含量高浓度组仍显著高于对照组(P＜0.05)，中、低浓度组与对照组已无显著差异(P＞0.05)。图中不同的字母表示同一时间段处理组间差异显著(P＜0.05)。

图3 急性氨氮胁迫对大口黑鲈幼鱼不同组织MDA 含量的影响Fig.3 Effects of acute ammonia-N stress on MDA content in different tissues of juvenile M.salmoides

3 讨论

研究表明养殖水体中过量的氨氮会破坏鱼类的抗氧化系统[10]。氨氮会参与体内氧化还原反应产生大量氧自由基，MDA 是氧自由基脂质过氧化反应的产物之一，能与细胞内的蛋白质分子发生聚合反应，导致蛋白质结构发生改变的细胞的正常功能受损，所以MDA 含量可以间接反映水生动物细胞受氧自由基损伤的程度[11-14]。过多的氧自由基会产生过量的H2O2，CAT 可催化H2O2生成H2O 和O2，防止过多的氧自由基积存体内造成损伤，可被用作生物标志物用来检测养殖水体中的氨氮污染[15-16]。磷酸酶是一种广泛存在于生物体内起去除底物磷酸基团作用的水解酶，是水生动物机体内重要的非特异性免疫相关酶[17]。磷酸酶有碱性磷酸酶和酸性磷酸酶两种类型，其中酸性磷酸酶主要存在于巨噬细胞溶酶体内，在生物体内起调控磷代谢的重要作用，还能有助于巨噬细胞及时识别、吞噬及降解异物[18]，在免疫反应中发挥重要作用，同时也是水生动物体内重要的解毒体系关键酶[19-20]。

急性氨氮胁迫后大口黑鲈的不同组织中MDA 含量肾＞脑＞鳃＞肠＞肝，其大小分别是应激处理前的2.22、10.63、2.85、6.23、3.29 倍，其中肾脏MDA 含量最高，显著高于其他各组织(P＜0.05)；CAT 活性为肝＞肾＞脑＞鳃＞肠，较应激处理前分别上升了46.78%、63.79%、89%、65.34%，而肠中则一直处于下降趋势，ACP活性肾＞鳃＞肝＞肠＞脑，其大小分别是应激处理前的2.69、5.58、1.76、2.43、2.82 倍，各组织中ACP 活性存在显著差异(P＜0.05)，肾中活性显著高于其他各组织(P＜0.05)。硬骨鱼的头肾主要是由淋巴细胞、红血细胞等组成，是机体内重要的造血和免疫器官。肝脏最主要的功能就是解毒和代谢功能，是鱼体中最主要的解毒代谢器官，体内的各种毒物、废物必须依靠肝脏来解毒，胁迫后这些数据特征与其器官功能的相吻合。

ACP、CAT(除肠部)活性及MDA 含量在96 h 的实验时间内总体上均呈现先升高后逐渐降低的变化趋势，这与王贞杰等[6]对圆斑星鲽Verasper variegatus、许星鸿等[21]对日本蟳Charybdis japonica、PEYGHAN，et al[22]对鲤鱼Cyprinus carpio 的相关研究结论一致。当氨氮胁迫时机体快速启动应激反应生成大量CAT、ACP 以应对胁迫造成的危害，6 h 时CAT 在肝、肾、鳃部均达到了最大值，脑部可能由于血脑屏障的存在，对外部的胁迫影响相对滞后；肠道是重要的消化吸收器官，鱼体通过吞咽作用使氨氮通过肠壁快速进入肠组织中，由于进入到肠组织中氨氮量较大，致使肠中CAT 快速降至最低并受到抑制，无法在短期内清除自由基，导致肠中MDA 明显高于其他各组织，而此时肠中ACP 作为重要的解毒体系关键酶快速升高，来降低MDA 等有害物质的积累对机体的伤害。随着胁迫的继续MDA(除肾48 h)均在12 h 累积至最大值，随着机体CAT 等酶的进一步激活，逐渐降低；各组织中CAT 在6-12 h，ACP 在24～48 h 达到峰值，随后逐渐下降；至96 h 时各组织的高浓度组MDA 含量均显著高于对照组(P＜0.05)，而且清除趋势显著减缓，ACP、CAT的中、高浓度组均分别显著高于和低于对照组(P＜0.05)，说明此时这2 个浓度组胁迫下部分细胞功能已受损，尤其是肠中CAT 各浓度组均显著低于对照组(P＜0.05)，且无恢复的趋势，此时细胞功能受到了严重抑制，说明尽管大口黑鲈氨氮的96 h LC50为63.33 mg·L-1，但当氨氮浓度28.5 mg·L-1时经96 h 的胁迫其部分组织中的细胞功能已经受到损伤。

综上，养殖水体中的氨氮会破坏大口黑鲈免疫系统，导致免疫力下降发生病害死亡，从而造成经济损失。因此，在养殖过程中应注意将氨氮浓度控制在安全范围内，其鳃ACP 活性和鳃、肠CAT 活性能够准确反映所受损伤的程度，可作为评价养殖水体中氨氮毒性的标志物。