甲巯咪唑治疗Graves病诱发白细胞减少患者Th17/Treg细胞及相关因子的变化及意义*

尚恒，马金刚，魏红丽，杨华，范斌，路林峰

（沧州市人民医院 1.内分泌科，2.体检中心，3.供应室，4 心内科，河北 沧州 061000）

Graves 病是一种常见的自身免疫性甲状腺疾病，细胞免疫功能的异常在其发病机制中发挥了重要作用[1]。甲巯咪唑是临床中常用的治疗Graves 病的药物，它除了可抑制甲状腺激素合成外，还可以快速调节Graves 病患者细胞免疫功能的异常，发挥治疗作用[2]。但治疗过程中常会诱发白细胞减少，其发生率可达10%左右[3]。那么甲巯咪唑治疗Graves 病过程中出现白细胞减少患者与正常白细胞患者在治疗前其外周血细胞免疫功能的异常是否存在不同，目前这方面的研究较少。

近年来Treg、Th17 细胞在自身免疫性疾病中的机制研究较多，Th17/Treg 细胞免疫失衡会导致Graves病的发生、发展[4]。本研究拟通过分析甲巯咪唑治疗Graves 病过程中出现白细胞减少患者与正常白细胞患者治疗前外周血Th17/Treg 及其分泌的细胞因子IL-17、TGF-β 水平，探讨细胞免疫功能的变化在甲巯咪唑诱发白细胞减少中的临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2017年12月—2018年6月于沧州市人民医院内分泌科门诊或住院的初发Graves 病65 例患者作为研究对象。根据患者的年龄、病情和甲状腺激素水平，给予甲巯咪唑[0.5～0.7 mg/（kg·d）]治疗，并辅以普萘洛尔降低心率，根据甲状腺功能（以下简称甲功）变化的情况，逐渐调整甲巯咪唑治疗剂量，以甲巯咪唑治疗的前3 个月作为观察期。选取观察期内出现白细胞减少症的Graves 病患者30 例作为白细胞减少组。其中，男性8 例，女性22 例；平均年龄（30.28±6.53）岁；平均病程（7.62±2.93）个月。选取正常白细胞Graves 病患者35 例作为正常白细胞组。其中，男性10 例，女性25 例；平均年龄（33.53±7.64）岁；平均病程（9.12±3.81）个月。选取同期来本院健康体检者50例作为对照组。其中，男性20例，女性30 例；平均年龄（32.51±6.84）岁。Graves 病诊断依据《中国甲状腺疾病诊治指南》[5]：①高代谢的症状和体征；②触诊及B 超检查弥漫性甲状腺肿大；③血清总甲状腺素（total tyroxine 4, TT4）、游离甲状腺素（free tyroxine 4, FT4）增高，促甲状腺激素（thyroid stimulating hormone, TSH）减低；④眼球突出和其他浸润性眼征；⑤胫前黏液性水肿；⑥促甲状腺素受体抗体（thyrotropin receptor antibody, TRAb）、甲状腺过氧化物酶抗体（thyroid peroxidase antibody, TPOAb）阳性。以上①～③项为诊断必备条件，④～⑥项为诊断辅助条件。白细胞减少症诊断依据：外周血白细胞绝对计数持续＜4.0×109/L 定义为白细胞减少症，外周血中性粒细胞绝对计数＜2.0×109/L 定义为粒细胞减少症，＜0.5×109/L 定义为粒细胞缺乏症。排除标准：①治疗前存在白细胞减少、肝功能损害患者；②其他自身免疫性疾以及近期有免疫抑制剂或者皮质类固醇使用者；③亚临床甲状腺功能亢进症（以下简称甲亢）、妊娠、近期感染、各种恶性肿瘤及肾功能衰竭患者。由于本研究不探讨甲巯咪唑诱发肝损害及其他不良反应的情况，因此需排除甲巯咪唑治疗后出现肝功能损害及其他不良反应患者。本研究经沧州市人民医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 标本采集及外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMC）的分离空腹抽取研究对象静脉血5 ml，分离血清用于甲功、甲状腺自身抗体及细胞因子的检测。空腹抽取研究对象肝素抗凝静脉血5 ml，行Ficoll 密度梯度离心法分离PBMC，调整细胞密度为1×106个/ml，悬浮于RPMI 1640 培养液中。

1.2.2 Treg、Th17 细胞的分选Treg 细胞测定：将上述PBMC 与PE-抗人CD4 单克隆抗体（美国eBioscience 公司）、抗人CD25-APC（美国eBioscience公司）进行细胞表面染色，用PE-抗人Foxp3 单克隆抗体进行细胞内因子染色，采用流式细胞分析仪（型号：FACS Calibur，美国BD 公司）检测。Th17 细胞测定：将PBMC 悬液置于24 孔培养板内，每孔加入佛波酯（美国Alexis 公司）25 ng/ml，伊诺霉素（美国Alexis公司）1μg/ml 后，在37℃孵育箱中培养4 h，收集细胞，加入PE-抗人CD4 单克隆抗体进行细胞表面染色，用PE-抗人IL-17A 单克隆抗体进行细胞内因子染色，采用流式细胞分析仪检测。用CellQuest 软件分析数据，以CD4+CD25+Foxp3+/CD4+T 表示Treg、Th17 细胞百分比。

1.2.3 甲功及甲状腺自身抗体的测定采用美国罗氏公司的Cobase601 型电化学发光全自动免疫分析系统测定游离三碘甲腺原氨酸（free triiodothyronine,FT3）、FT4及TSH 的水平，采用配套试剂盒。采用美国Beckman Coulter 分析仪通过免疫化学发光法测定甲状腺球蛋白抗体（thyroglobulin antibody, TgAb）、甲状腺过氧化物酶抗体（thyroid peroxidase antibody,TPO-Ab）及促甲状腺激素受体抗体（thyrotrophin receptor antibody, TRAb）水平，均采用配套试剂盒。

1.2.4 细胞因子的测定采用ELISA 法检测细胞因子，采用美国R＆D 公司生产的血清TGF-β、IL-17 ELISA 试剂盒，严格按照试剂盒说明书操作。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0 统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用方差分析，进一步的两两比较用LSD-t检验；计数资料以率（%）表示，比较用χ2检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组临床资料比较

各组年龄、性别及病程比较，差异无统计学意义（P＞0.05），各组甲功、甲状腺自身抗体水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05），正常白细胞组、白细胞减少组FT3、FT4、TgAb、TPO-Ab 及TRAb 较对照组高，TSH 较对照组低，进一步的两两比较显示，白细胞减少组与正常白细胞组FT3、FT4及TPO-Ab 水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05），白细胞减少组较正常白细胞组高。见表1。

表1 各组临床资料比较

2.2 各组外周血中Th17、Treg 细胞在CD4+T 细胞中的百分比及Th17/Treg 比较

各组Th17 细胞在CD4+T 细胞中的百分比比较，差异有统计学意义（P＜0.05），正常白细胞组、白细胞减少组均较对照组高（P＜0.05）。各组Treg 细胞在CD4+T 细胞中的百分比比较，差异有统计学意义（P＜0.05），白细胞减少组、正常白细胞组较对照组低（P＜0.05），进一步的两两比较显示，白细胞减少组与正常白细胞组Treg 细胞在CD4+T 细胞中的百分比比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。各组Th17/Treg 比较，差异有统计学意义（P＜0.05），正常白细胞组、白细胞减少组均较对照组高（P＜0.05），进一步的两两比较显示，白细胞减少组与正常白细胞组Th17/Treg比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 各组外周血中Th17、Treg 细胞在CD4+T 细胞中的百分比及Th17/Treg 比较 （±s）

表2 各组外周血中Th17、Treg 细胞在CD4+T 细胞中的百分比及Th17/Treg 比较 （±s）

组别 n Th17/% Treg/% Th17/Treg白细胞减少组 30 3.36±0.61 3.15±1.11 1.26±0.67正常白细胞组 35 2.88±0.50 3.41±0.94 0.92±0.36对照组 50 1.44±0.32 7.40±2.71 0.23±0.11 F 值 187.201 62.929 69.803 P 值 0.000 0.000 0.000

2.3 各组TGF-β、IL-17 及IL-17/TGF-β 比较

各组TGF-β、IL-17 及IL-17/TGF-β 比较，差异有统计学意义（P＜0.05），白细胞减少组、正常白细胞组IL-17、IL-17/TGF-β 较对照组高（P＜0.05），TGF-β 较对照组低（P＜0.05），进一步的两两比较显示，白细胞减少组与正常白细胞组TGF-β、IL-17 及IL-17/TGF-β 比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 各组TGF-β、IL-17 及IL-17/TGF-β 比较 （±s）

表3 各组TGF-β、IL-17 及IL-17/TGF-β 比较 （±s）

IL-17/TGF-β白细胞减少组 30 15.60±2.79 4.50±1.56 3.96±1.81正常白细胞组 35 11.33±2.00 8.30±1.71 1.43±0.42对照组 50 6.62±1.20 15.25±3.33 0.46±0.15 F 值 201.391 186.692 126.876 P 值 0.000 0.000 0.000组别 n IL-17/（pg/ml）TGF-β/（pg/ml）

3 讨论

Graves 病的发生、发展是在遗传易感性和环境因素异常的背景下，导致抑制性T 细胞功能缺陷，辅助性T 细胞定向分化，体液免疫和细胞免疫相互作用，刺激B 细胞产生促甲状腺受体抗体，从而导致甲亢[6]。Th17、Treg 细胞作为新近研究的T 细胞亚群，在自身免疫性甲状腺疾病的发生、发展中发挥了重要的作用。Th17 细胞具有很强的致炎功能，其分泌的细胞因子可引起炎症细胞的浸润和组织破坏，与炎症反应的活动性和疾病严重程度相关[7]。Treg 细胞具有强大免疫抑制功能，它通过分泌TGF-β 等细胞因子发挥负性免疫调节作用，而特异性转录因子Foxp3 在其分化中起着关键作用[8]。Th17 与Treg 细胞存在着相互拮抗的作用，Th17/Treg 细胞平衡，可维持机体处于免疫耐受稳态；而在炎症反应及自身免疫性疾病时，T 细胞的分化受到影响，Treg 细胞分化被抑制，Th17 细胞分化增强，使得Th17/Treg 细胞平衡受到破坏，从而导致机体的损伤[9]。

本研究中发现白细胞减少组及正常白细胞组患者CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞在CD4+T 细胞中的百分比及其分泌的细胞因子TGF-β 的水平较对照组明显下降，而CD4+IL-17A+Th17 细胞在CD4+T 细胞中的百分比及其分泌的细胞因子IL-17 的水平较对照组明显升高，提示抑制性T 细胞功能缺陷，辅助性T细胞不适当的致敏参与了Graves 病的发生，这也与BOSSOWSKI 等[4]研究结果一致。

甲巯咪唑是临床中常使用的抗甲状腺药物，白细胞减少是甲巯咪唑治疗Graves 病过程中常见的不良反应，其发生率可达10%左右。而多数学者认为甲巯咪唑治疗Graves 病出现白细胞减少或缺乏是一个免疫介导的过程，可能与骨髓抑制、存在抗中性粒细胞自身抗体及影响粒细胞某些代谢通道的毒性作用有关[10]。那么Th17/Treg 细胞免疫功能的异常是否对甲巯咪唑诱发白细胞减少的发生产生了影响？本研究比较Treg细胞在白细胞减少组中与正常白细胞组的百分比发现，白细胞减少组虽然有降低的趋势，但差异无统计学意义。而比较Treg 细胞分泌的细胞因子TGF-β 的水平发现，白细胞减少组较正常白细胞组明显降低，差异有统计学意义，表明Treg 细胞的数目在白细胞减少组虽然无明显的降低，但其免疫功能的缺陷在白细胞减少组中更加明显。比较两组中Th17 细胞及其分泌的细胞因子IL-17 的水平的差异发现，Th17 细胞的所占百分比以及IL-17 的水平在白细胞减少组中升高更加明显，差异有统计学意义，提示白细胞减少组中可能存在更加严重的炎症反应。在Th17/Treg 比值方面，白细胞减少组中Th17/Treg 及IL-17/TGF-β 的比值最高，表明Th17/Treg 细胞免疫失衡在白细胞减少组中更加明显，且向Th17 细胞漂移。由于抑制性T细胞功能明显降低，致炎细胞功能亢进，推测在白细胞减少组患者中存在更加严重的炎症反应。Th17/Treg细胞免疫失衡向Th17 细胞漂移参与了甲巯咪唑诱发白细胞减少的发生。

甲巯咪唑除了通过抑制甲状腺内过氧化酶系统，阻断离子碘生成活性碘过程，减少甲状腺素、三碘甲状腺原氨酸合成外，还可以通过调节Graves 病自身免疫紊乱发挥治疗作用。COTE-BIGRAS 等[11]提到，经甲巯咪唑治疗后可以迅速提高Graves 病患者外周血Treg 细胞的水平，缓慢降低Th17 细胞水平，逐渐纠正Th17/Treg 免疫失衡，且Th17/Treg 免疫平衡稳定的时间与Graves 病复发的时间呈正相关。推测由Th17 细胞所介导的炎症反应外周血中性粒细胞的动员、募集发挥了重要作用。

综上所述，因此及时纠正Th17/Treg 细胞免疫失衡向Th17 细胞漂移，能够减少甲巯咪唑诱发白细胞减少的发生，提高治疗Graves 病的安全性。为临床治疗Graves 病提供新的免疫学依据。