miR-499a-5p通过靶向APC减轻氧化应激对心肌细胞损伤的研究

武国利 张宁 田蜜 田征 许金鹏 马竞 杨泽峰

【摘  要】目的：探讨miR-499a-5p通过靶向APC减轻氧化应激对心肌细胞损伤的研究。方法：将H9c2细胞培养时使用含DMEM培养基（10 %胎牛血清）进行常规的培养、传代，将正常培养的H9c2细胞标记为对照组，将其用H2O2（100、200、400、800μmol/L）处理4 h，检测细胞的存活率，筛选400μmol/L的浓度建立氧化应激损伤模型，标记为模型组，比较两组的心肌miR-499-5p表达及APC表达。结果：模型组miR-499-5p表达明显低于对照组，而APC表达明显高于对照组（P<0.05）。结论：miR-499a-5p可调控H2O2诱导的心肌细胞增殖、凋亡和氧化应激，其机制与靶向抑制APC有关，为氧化应激引起的心肌细胞损伤提供了新的治疗靶点。

【关键词】心肌细胞损伤;氧化应激;miR-499a-5p;APC

【中图分类号】R197      【文献标识码】A      【文章编号】1672-3783（2020）07-0108-01

氧化应激引起的心肌细胞凋亡是很多心脏疾病的重要作用机制，这也是心血管疾病治疗的研究热点。miRNA在人类疾病中的重要作用已经得到大量研究的认可，但是心血管疾病miR-499a-5p在心肌细胞损伤中的功能尚未完全清楚[1]。活化蛋白C（APC）是一种重要的生理抗凝剂，其由蛋白C介导的细胞途径发挥直接的细胞调控，如抗炎活性、抗凋亡活性和内皮保护障碍。据报道，APC在缺血再灌注心肌损伤中具有有益作用，对心肌细胞凋亡和炎症具有抑制作用[2]。但是，其与miR-499a-5p在心肌氧化应激损伤中的作用关系尚未清楚。本研究旨在探索miR-499a-5p在H2O2诱导的心肌细胞损伤中的作用及其与APC之间的关系，以期可为氧化应激引起的心肌细胞损伤的治疗提供新靶点。

1.资料与方法

1.1一般资料 采用深圳市百恩维生物科技有限公司生产的大鼠心肌细胞H9c2，使用含DMEM培养基（10 %胎牛血清）进行常规的培养、传代。将正常培养的H9c2细胞标记为对照组，将其用H2O2（100、200、400、800 μmol/L）处理4 h，检测细胞的存活率，筛选400μmol/L的浓度建立氧化应激损伤模型，标记为模型组。

1.2miR-499a-5p、APC的表达检测方法： 采用qRT-PCR检测，收集细胞，将细胞用Trizol法提取细胞中的总RNA，再用反转录试剂盒将其合成cDNA。最后用qRT-PCR试剂盒操作，检测细胞中miR-499a-5p、APC的表达。以U6、GAPDH为内参，2-△△Ct检测细胞中miR-499a-5p、APC的相对表达量。20 μL逆转录反应混合物在42℃孵育15 min，加热到95℃反应2min。qRT-PCR条件在95℃10 s，然后 95℃，5 s，60℃，30 s，72℃，1 min，45个循环。引物信息（5'-3'）：miR-499a-5p 上游引物5'-AACAUCACAGCAAGUCUGUGCU-3'，下游引物miR-499a-5p 5'-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3';U6上游引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3' ，下游引物5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3';APC上游引物5'-GGACTACAGGCCATTGCAGAA-3'，5'-GGCTACATCTCCAAAAGTCAA-3';GAPDH上游引物 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游引物5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'[3]。

1.3统计学方法 应用 SPSS20.0 统计学软件，计量资料用均数±标准差（ ±s）表示，采用t检验，P<0.05为有统计学意义。

2.结果

2.1两组miR-499a-5p、APC表达比较，见表1。

3.讨论

miR-499-5p是进化上高度保守的肌肉特异性micro RNA，其在心室中的表达明显升高。临床研究表明，在心肌缺血缺氧或氧化应激状态下，心肌细胞的miR-499表达发生改变，表现为miR-499表达降低，抵抗心肌细胞缺氧性损害。本研究结果显示，模型组的miR-499-5p表达明显低于对照组，而APC水平明显高于对照组（P<0.05）。提示miR-499-5p可能参与心肌氧化应激的病理过程中，而APC过表达能逆转miR-499-5p对心肌细胞的损伤[4]。

综上所述，miR-499a-5p可调控心肌细胞的增殖、凋亡和氧化应激反应，临床可通过靶向抑制APC，减轻氧化应激对心肌细胞损伤。

参考文献

[1] 王晓景，张明星，陈小亮.miR-20a-5p通过靶向MRTFA緩解ox-LDL诱导的内皮细胞损伤[J].中国动脉硬化杂志，2019，27（9）：743-750.

[2] 王彦利，李纪明，罗进光.miR-137靶向下调SETD7表达对缺氧复氧诱导的心肌细胞氧化应激的影响研究[J].分子诊断与治疗杂志，2019，11（6）：462-467.

[3] 吴丽梦，李恩，周小翠等.miR- 499-5p干预对心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡的影响[J].郑州大学学报（医学版），2018，53（5）：614-618.

[4] 崔瑞新，吕风华，岳莹等.microRNA-499靶控的PI3K/Akt通路在大鼠缺血-再灌注心肌损伤中的作用[J].郑州大学学报（医学版），2016，51（6）：740.