毓麟珠方加减对反复移植失败患者非移植周期子宫内膜容受性的影响

王晨晔 丁彩飞 张 伟 鲍严钟

体外受精-胚胎移植（in vitro fertilizstion and embryo transfer，IVF-ET）目前被广泛应用于不孕症的治疗；其单周期妊娠率最高可达60%，但总体妊娠率30%～45%，这与反复胚胎移植失败（repeated implantation failure，RIF）密切相关[1]。毓麟珠加减方为国家级名老中医鲍严钟医师临证经验方，由《景岳全书·妇人规》“毓麟珠”方加减而成，临床可提高RIF患者再移植临床妊娠率，但机制尚不明确。本研究拟从中医证候、血清miRNA-31 水平、子宫内膜叉头/翼状螺旋转录因子3（Foxp3）、内皮型一氧化氮合酶（eNOS）表达入手，探讨此经验方治疗RIF 患者子宫内膜容受性的作用机制，报道如下。

1 临床资料

1.1 一般资料 2017 年1 月—2019 年5 月于浙江省中西结合医院生殖医学科门诊或住院治疗确诊为肾虚型RIF 患者移植前（非移植周期）30 例为治疗组，欲行人工受精的曾有妊娠史的已婚育龄期女性30 例为对照组。本研究经医院伦理委员会审核通过，符合《赫尔辛基宣言》中的相关要求，研究对象签署知情同意书。

1.2 对照组纳入、排除标准 纳入标准：（1）40 岁以下，育龄妇女；（2）月经周期规律，基础体温双相；（3）近3 个月未服用激素治疗；（4）B 超检查子宫、卵巢无器质性病变；（5）B 超检测显示排卵日子宫内膜厚度≥7mm；（6）未同时参加其他临床试验的患者；（7）曾有正常妊娠史。排除标准：（1）患有甲状腺、肾上腺疾患及糖尿病等内分泌疾病；（2）患有心、脑、肝、肾等严重疾病；（3）精神病患者。

1.3 RIF 治疗组纳入、排除标准 纳入标准：（1）符合RIF 诊断标准[2]；（2）符合中医辨证分型诊断标准:“不孕症”肾虚型，具体参照新世纪全国高等中医药院校规划教材《中医妇科学》第2 版的有关内容[3]。（3）近3 个月内未服激素类药物及其他影响生殖内分泌的药物。排除标准：（1）合并心、肝、肾和造血系统等严重疾病者；（2）存在染色体异常、内分泌失调、生殖道感染、自身免疫性疾病等病因；（3）存在未治愈的子宫内膜疾病（息肉、宫腔粘连、宫腔疤痕），重度子宫内膜异位症，多囊卵巢综合征排卵障碍者，传染病活动期，输卵管重度积水等；（4）精神病患者；（5）未按规定用药治疗无法判断疗效，或者资料不全无法判断结果者；（6）参加其他临床试验的患者。

2 方 法

2.1 治疗方法 RIF 治疗组给予毓麟珠方加减（生晒参9g，白术、茯苓、川芎各12g，巴戟天、鸡血藤、熟地、白芍、当归、菟丝子、杜仲各15g，鹿角霜、制首乌、覆盆子各10g，柴胡6g，紫河车粉3g 等），水煎服，每天1 剂，煎取200mL 分早、晚2 次服；从月经周期第5 天开始，连续服用21 天为1 个疗程，连续治疗3 个疗程。对照组不予任何药物治疗。嘱研究对象在研究过程中使用阻隔性避孕方法，排除由于接触伴侣的精液可能会影响子宫内膜中的细胞因子表达。

2.2 观察指标

2.2.1 肾虚证候评分[4-5]RIF 治疗组患者治疗前后肾虚证候评分变化（由2 名固定中医主治医师共同完成）。

2.2.2 qRT-PCR 法检测血清miRNA-31 水平 对照组及RIF 治疗组治疗前后均于黄体中期（排卵后第7 天），收集患者外周静脉血5mL，行外周血单一核细胞（PBMC）的分离：EDTA 抗凝，Ficoll 密度梯度离心法分离PBMC，用于血清miRNA-31 水平测定。按照Trizol（Invitrogen，美国）说明书操作提取分离PBMC 的总RNA，反转录得到cDNA。miRNA-31、内参U6 引物通过PUBMED primer-blast 设计，由杭州旸明生物技术有限公司合成。序列如下：miRNA-31正向引物：5＇-AGGCAAGATGCTGGC-ATAGCT-3＇；miRNA-31 反向引物：5＇-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3′；内参U6 正向引物：5′-ACGCAAATTCGTGAAGCGTT-3′；内参U6 反向引物：5′-GAGAGCACAGAATACGAC-3′。所有反应均设立3 个复孔，PCR条件：95℃30s 预变性，95℃5s，60℃30s，72℃30s进行40 个循环。以U6 作为内参基因。PCR 扩增参照试剂说明书。在2.0%的琼脂糖凝胶下行电泳，电泳条带结果用VDS 图像分析系统分析。以miRNA-31的吸光度与U6 吸光度的比值，表示miRNA-31 相对表达水平。

2.2.3 qRT-PCR 法检测子宫内膜Foxp3、eNOS mi-RNA 表达 对照组患者入组后、RIF 治疗组患者治疗前后，均于黄体中期（排卵后第7 天）用PiPette 管（宁波天益公司）吸取子宫内膜组织，取材后用0.9%氯化钠溶液冲洗杂质后，于-80℃保存，用于子宫内膜Foxp3、eNOS miRNA 表达测定。按照Trizol 说明书操作提取子宫内膜组织总RNA，反转录得到cDNA。Foxp3、eNOS 及内参GAPDH 引物通过PUBMED primer-blast 设计，由杭州旸明生物技术有限公司合成。序列如下：Foxp3 miRNA 正向引物：5′-CTGACCAAGGCTTCATCTGTG-3′；Foxp3 miRNA 反向引物：5′-ACTCTGGGAATGTGCTGTTTC-3′；eNOS miRNA正向引物：5′-GCACATGGCCTTGGACTGA-3′；eNOS miRNA 反向引物：5′-TCCCAGTTCTTCACACGAGG-3′；内参GAPDH 正向引物：5′-GCTGGCGCTGAGTACGTCGT-3′；内参GAPDH 反向引物：5′-TGGGTGTCGCTGTTGAAGTC-3′。所有反应均设立3 个复孔，PCR 条件：95℃30s 预变性，95℃5s，60℃30s，72℃30s 进行40 个循环。以GAPDH 作为内参基因。PCR扩增参照试剂说明书。电泳条带结果用VDS 图像分析系统分析。以Foxp3 的吸光度与GAPDH 吸光度的比值，表示Foxp3 miRNA 相对表达水平；以eNOS 的吸光度与GAPDH 吸光度的比值，表示eNOS miRNA相对表达水平。

2.2.4 不良反应 试验中如出现不良反应，予以记录、随访。

2.3 统计学方法 应用SPSS 19.0 统计软件对数据进行统计。计量数据以均数±标准差（） 表示，用t检验；计数资料采用χ2检验；血清miRNA-31 水平与子宫内膜Foxp3、eNOS miRNA 相对表达水平的相关性采用Pearson 相关分析；P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 两组研究对象一般资料比较 RIF 治疗组30例，年龄（32.32±2.79）岁，体质指数（BMI）（22.19±3.28）kg/m2；对照组30 例，年龄（31.56±2.83）岁，BMI（22.35±2.67）kg/m2。两组研究对象年龄、BMI 比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

3.2 RIF 治疗组治疗前后中医证候评分比较 RIF治疗组治疗后中医证候评分（12.23±2.01）分，显著低于同组治疗前（17.97±3.59）分，差异有统计学意义（P＜0.01）。

3.3 两组研究对象黄体中期血清miRNA-31 表达水平比较 黄体中期，RIF 治疗组患者治疗前血清miRNA-31 水平显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）；RIF 治疗组患者治疗后血清miRNA-31水平显著低于同组治疗前，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

表1 两组研究对象黄体中期血清miRNA-31 表达情况比较（）

表1 两组研究对象黄体中期血清miRNA-31 表达情况比较（）

注：RIF 治疗组给予毓麟珠方加减治疗3 个疗程；对照组不予任何药物治疗；RIF 为反复胚胎移植失败；与对照组比较，aP＜0.01；与同组治疗前比较，bP＜0.01

3.4 两组研究对象黄体中期子宫内膜Foxp3 miRNA、eNOS miRNA 表达水平比较 黄体中期，RIF 治疗组治疗前子宫内膜Foxp3、eNOS miRNA 水平均显著低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）；RIF 治疗组治疗后子宫内膜Foxp3、eNOS miRNA 水平均显著高于同组治疗前，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表2。

3.5 RIF 治疗组黄体中期血清miRNA-31 与子宫内膜Foxp3、eNOS miRNA 表达相关性分析 相关分析结果显示，黄体中期RIF 治疗组血清miRNA-31 水平与子宫内膜Foxp3、eNOS miRNA 表达水平均呈负相关关系（r=-0.459，P=0.042；r=-0.503，P=0.035）。

表2 两组研究对象黄体中期子宫内膜Foxp3、eNOS miRNA表达水平比较（）

表2 两组研究对象黄体中期子宫内膜Foxp3、eNOS miRNA表达水平比较（）

注：RIF 治疗组给予毓麟珠方加减治疗3 个疗程；对照组不予任何药物治疗；RIF 为反复胚胎移植失败；Foxp3 为子宫内膜叉头/翼状螺旋转录因子3；eNOS 为内皮型一氧化氮合酶；与对照组比较，aP＜0.01；与同组治疗前比较，bP＜0.01

3.6 不良反应 研究过程中RIF 治疗组患者均未发生明显不良反应。

4 讨论

目前RIF 的发病机制仍不十分明确。子宫内膜免疫功能紊乱、内膜下血管新生异常，都可降低子宫内膜容受性，并与RIF 和复发性流产（recurrent miscarriage，RM）密切相关[6-7]。研究发现，miRNA-31 在不明原因RM 患者蜕膜组织表达高于正常妊娠组[8]。由于RIF 和RM 密切相关，推测miRNA-31 可能对评价RIF 子宫内膜容受能力有一定临床价值。研究发现，Foxp3 作为Fox 转录因子家族成员，RIF 患者外周血和子宫内膜组织中Foxp3+Tregs 表达量减少[9]。Foxp3 表达量增高，可使母体免疫系统不排斥胚胎的植入和发育[10]。子宫内膜eNOS 是一氧化氮同工酶的亚型之一。动物实验发现，eNOS/NO 能够促进着床信号的启动，并能改善子宫内膜的血供，增进蜕膜化程度，从而增加妊娠的机会[11]。

鲍严钟认为，肾为冲任之本，胎之所系，肾虚则胎孕难成；若肾气肾阳充沛，胞宫得以温煦，则能摄精成孕。故采用“毓麟珠”方加减治疗RIF 患者，方中八珍汤荣养一身之气血，濡养胞宫、胞脉、冲任二脉；杜仲、菟丝子、覆盆子补肾益精；鹿角霜、巴戟天温补肾精肾阳；女贞子益肾养阴；鸡血藤补血活血通络，柴胡疏肝理气。全方补肾与益气养血并重，通络胞脉，促胞胎受孕。药理研究表明，八珍汤有提高细胞免疫能力[12]。补肾中药有内分泌激素样作用，可提高子宫局部雌激素水平，促进受孕[13]。鹿角胶具有抗炎作用[14]。活血化瘀药物可抗凝血，改善子宫卵巢血液供给[15]。

本研究结果显示，RIF 治疗组黄体中期血清miRNA-31 水平显著高于对照组（P＜0.01），RIF 治疗组治疗后黄体中期血清miRNA-31 水平显著低于同组治疗前（P＜0.01）。提示毓麟珠方加减可能通过调节血清miRNA-31 水平发挥改善子宫内膜容受性的作用。本研究还显示，RIF 治疗组治疗前子宫内膜Foxp3、eNOS miRNA 水平均显著低于对照组（P＜0.01），RIF 治疗组治疗后子宫内膜Foxp3、eNOS miRNA 水平均显著高于同组治疗前（P＜0.01），提示RIF 患者可能存在子宫内膜母胎界面免疫调控紊乱以及内膜血管新生障碍，从而影响胚胎的成功植入；毓麟珠方加减可增加RIF 患者种植窗口期子宫内膜Foxp3、eNOS 表达，调控母胎界面免疫平衡紊乱，促进血管新生，促进胚胎植入。此外，RIF 治疗组血清miRNA-31 水平与子宫内膜Foxp3 miRNA 表达水平的Pearson 相关分析结果显示，两者呈负相关关系（P＜0.05），这与既往文献报道结果基本一致[11]。而血清miRNA-31 水平与子宫内膜eNOS miRNA 表达水平的Pearson 相关分析结果也显示，两者呈负相关关系（P＜0.05），考虑miRNA-31 表达上调可能抑制eNOS 表达，而eNOS 表达下降导致种植窗期血管内皮细胞功能障碍，影响内膜血管重塑，这可能是IVF-ET 中RIF 的原因之一。

综上可见，miRNA-31 对无创评价RIF 子宫内膜容受性具有一定的临床意义。毓麟珠方加减治疗RIF 患者移植前，可改善子宫内膜容受性，且未见不良反应。但由于本次研究样本量有限，研究结果可能存在一定局限性。以期在之后的研究中，增加样本量，以及开展实验相关研究，以此丰富RIF 子宫内膜容受性中医药研究的机制内容。