理气化痰祛瘀方对高脂血症模型金黄地鼠炎症的干预作用及机制研究

朱 博 陈 攀 王 辉 丁 科

目前冠心病、动脉粥样硬化等心脑血管疾病是影响人类健康的主要疾病之一，而高脂血症又是诱导疾病的重要因素，中医药治疗高脂血症得到普遍认可并具有广泛的前景[1]。Toll 样受体4（TLR4）的激活与脂多糖（LPS）密切相关，并启动炎症反应，肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF-6）是TLR4 下游信号分子中重要一环，在敲除TRAF-6 基因的小鼠中，TLR4 介导的炎症因子及趋化因子明显减少[2-3]。本研究采用金黄地鼠作为实验动物，建立饮食性高脂血症模型，观察给药后造模地鼠血脂生化指标变化，采用酶联免疫吸附（ELISA）法分别检测炎症因子血清白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）含量和肝脏组织胆固醇7α 羟化酶（CYP7A1）含量；采用Western blot 检测和qRT-PCR 检测观察理气化痰祛瘀方对金黄地鼠肝脏组织TTLR4 和TRAF-6 的表达，探讨其在TLR4/TRAF-6 信号通路中所起的可能机制和作用。

1 实验材料

1.1 实验动物 SPF 雄性LVG 叙利亚金黄地鼠60只，7 周龄，体质量（120±10）g，由北京维通利华公司提供，动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0011，实验动物质量合格证号：11400700240693。于浙江中医药大学动物实验研究中心按屏蔽环境标准饲养，饲养室许可证号：SYXK（浙）2013-0184。本研究经医学伦理委员会审核通过。

1.2 药品及主要试剂 理气化痰祛瘀方（浙江中医药大学附属第一医院制剂室制备提供，批号201708-201711）；非诺贝特（上海衡山药业有限公司，批号23267）；生理盐水（河北天成药业股份有限公司，批号A17021309）；胆固醇（鑫汐生物，批号D12451）；起酥油（车轮牌，批号Q/ZPN0002S）；蛋黄粉（康德蛋业，批号D12450B）；3 号胆盐（源业生物有限公司，批号S31332-100g）；基础饲料（浙江省医科院，批号D110700）；TC、TG 试剂盒（雅培制药有限公司，批号4818UN16，1206UN16）；LDL-c、HDL-c 试剂盒（中生北控生物科技股份有限公司，批号92649095，92650099）；IL-6、TNF-α、CYP7A1 ELISA 检测试剂盒（上海信帆生物科技有限公司，批号均为201710）；RIPA 裂解液（碧云天，批号P0013D）；PMSF（Sigma，批号ST505）；蛋白酶抑制剂（碧云天，批号P1005）；BCA 蛋白定量试剂盒（Solarbio，批号pc0020）；HRP标记的二抗（华安生物，批号HA1001-100）；化学发光检测试剂（Affinity，批号K001/K002）；预染蛋白marker（Solarbio，批号PR1910）；TLR4（Proteintech，批号19811-1-AP）；TRAF-6（Affinity，批号AF5376）；β-Actin（华安，批号M1210-2）；TRIzon 总RNA 提取试剂（康为世纪，批号CW0580）；逆转录试剂盒（Takara，批号639503）；SYBR Green qPCR 试剂盒（Takara，批号RR430S）；无水乙醇（沪试，批号64-17-5）；氯仿（沪试，批号67-66-3）；异丙醇（沪试，批号67-63-0）。

1.3 主要仪器 C16000 型全自动生化检测仪（美国雅培公司）；NIKON ECLIPSE TI-SR 倒置荧光显微镜（日本尼康）；生化培养箱（上海齐欣）；Micro17R 低温高速离心机（Thermo）；CMaxPius 酶标仪（Spectia-Max）；VE 180C 电泳仪电泳槽（天能）；VE186 转膜仪（天能）；Mastercycler Pro 型PCR 仪（德国EPPENDORF）；5804R 型冷冻离心机（德国EPPENDORF）；CFX-96 touch 实时荧光定量PCR 仪（美国Bio-Rad）；紫外分光光度计（苏州岛津公司）；自动匀浆器（IKA 公司）。

1.4 动物分组及处理 60 只健康成年雄性LVG 叙利亚金黄地鼠，适应性饲养1 周，测定各项血脂指标筛选接近正常血脂水平的金黄地鼠，根据数字表随机分配法挑选8 只作为正常组，其余作为造模组，分别喂予普通饲料和高脂饲料（82.5%普通饲料、10%起酥油、2%胆固醇、0.5%3 号胆盐、5%蛋黄粉）。造模2 周后，禁食12h 采用尾静脉取血测定TC 含量，筛选TC＞6.76mmol/L 40 只作为高脂血症模型地鼠。

将成模地鼠根据数字表随机分配法分为五组，即模型组、理气化痰祛瘀方低、中、高剂量组（6.3、12.6、25.2g·kg-1·d-1）、非诺贝特组（150mg·kg-1·d-1），每组8 只，各组地鼠分别灌胃给予相应剂量药物，正常组和模型组分别灌服等容量生理盐水，每天1 次。6 周后解剖金黄地鼠，取肝脏称重0.2g，加入10 倍磷酸缓冲盐溶液（PBS），部分制备肝脏匀浆上清液，其余部分置放在-80℃液氮保存。

2 实验方法

2.1 金黄地鼠血清TC、TG、LDL-c 和HDL-c 生化指标检测 分别于高脂饲料饲喂第0、2、8 周，空腹禁食12h（不禁水），眼眶采血0.5mL，静置30min 后，3000 r/min 离心10min，制备血清备用。采用生化分析仪检测金黄地鼠血清TC、TG、LDL-c 和HDL-c 的含量。

2.2 ELISA 检测高脂血症金黄地鼠血清IL-6、TNFα 含量，肝脏组织CYP7A1 含量 给药后第6 周（饲喂第8 周），空腹禁食12h（不禁水），眼眶采血0.5mL，静置30min 后，3000r/min 离心10min，制备血清备用；解剖金黄地鼠，取肝脏称重0.2g，加入10 倍PBS 匀浆，制备肝脏匀浆上清液，严格按照试剂盒操作步骤进行。

2.3 Western blot 检测金黄地鼠肝脏组织TLR4 和TRAF-6 蛋白表达 肝脏组织加入RIPA 裂解液（含PMSF 和蛋白酶抑制剂） 匀浆，冰上裂解30min，12000rpm 离心5min，取上清。采用二喹啉甲酸（BCA） 法检测肝脏组织总蛋白浓度，用酶标仪A562nm 波长测定；加入缓冲溶液在沸水浴中变性，5%聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，分离胶经甲醇和转膜液浸湿的聚偏氟乙（PVDF）膜进行蛋白转膜；用含5%脱脂奶粉的封闭液封闭1.5～2h，将膜放入一抗稀释液平皿中，4℃摇床振荡孵育过夜，用TBST 洗膜10min×3 次；加入含辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗稀释液，室温摇床振荡反应1～2h；用TBST 洗膜10min×3 次。暗室X 线曝光，以β 肌动蛋白（β-Actin）抗体作为内参对照，通过比较目标蛋白的灰度值进行半定量分析。

2.4 qRT-PCR 检测金黄地鼠肝脏组织TLR4、TRAF-6 mRNA 水平 将液氮-80℃速冻保存的样品用康为世纪公司的Trizol 试剂盒进行总RNA 的提取，具体方法参照说明书。采用分光光度法检测提取RNA的OD 值并计算浓度，保证RNA 抽提纯度和完整性。用Takara 逆转录试剂盒将所得RNA 逆转录成cDNA。在Realtime PCR 仪上进行PCR 实时荧光反应，记录并分析其mRNA 表达量差异。qRT-PCR 实验所用引物的序列由上海生工生物工程有限公司提供，TLR4 上游其序列为5'-CTCAGAGAGAGCCAGTGGAA-3'，下游引物序列为5'-GGAGCATTAGTGAACCCTCG-3'；TRAF-6 上游引物序列为5'-CAACTTGTCAGCCCTCCTTT-3'，下游引物序列为5'-TGGAAGAATAGCCAGTGCTCT-3'，GAPDH 上游引物序列为5'-AACAGGGTGGTGGACCTCAT-3'，下游引物序列为5'-TGCTCTCAGTATCCTTGCTG-3'。qPCR 反应扩增体系为20μL：2×EvaGreen 扩增混合物（美国Bio-Rad 公司）10μL，前引物1μL，后引物1μL，cDNA 1μL，ddH2O 7μL。扩增条件：94℃1min；95℃10s 高温变性、58℃10s、72℃10s 退火/延伸，40 个循环。

2.5 统计学方法 应用SPSS 19.0 统计软件进行数据分析，所有数据以均数±标准差（） 表示，不同组间两两比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）中的LSD 法（最小显著性法），P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 理气化痰祛瘀方对高脂血症模型金黄地鼠血脂水平的影响 高脂饲喂第8 周（理气化痰祛瘀方给药第6 周），与正常组比较，模型组金黄地鼠TC、TG、LDL-c 含量明显升高（P＜0.05）。与模型组相比，理气化痰祛瘀方中、高剂量组和非诺贝特组TC、TG、LDL-c 含量显著下降（P＜0.05），HDL-c 含量无显著性差异（P＞0.05）。其中，非诺贝特组TC、TG、LDL-c含量下降程度最高，理气化痰祛瘀方给药后TC、TG、LDL-c 含量下降程度高低依次为理气化痰祛瘀方中、高、低剂量组[4]。见表1。

3.2 理气化痰祛瘀方对高脂血症模型金黄地鼠炎症因子的影响 与正常组比较，模型组大鼠血清IL-6、TNF-α 含量显著升高（P＜0.05），肝脏组织CYP7A1含量显著下降（P＜0.05）。非诺贝特和理气化痰祛瘀方给药6 周，与模型组比较，非诺贝特组、理气化痰祛瘀方中、高剂量组金黄地鼠血清IL-6、TNF-α 含量显著下调，肝脏CYP7A1 含量则显著上升（P＜0.05）。理气化痰祛瘀方给药6 周后金黄地鼠血清IL-6、TNF-α 含量下降程度高低依次为理气化痰祛瘀方高、中、低剂量组。见表2。

3.3 理气化痰祛瘀方对高脂血症模型金黄地鼠肝脏组织TLR4 和TRAF-6 蛋白表达水平的影响 与正常组比较，模型组金黄地鼠肝脏组织TLR4 和TRAF-6 蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。与模型组比较，非诺贝特组金黄地鼠肝脏组织TLR4 和TRAF-6 蛋白表达水平显著下调（P＜0.05）。与模型组比较，理气化痰祛瘀方低、中、高剂量组金黄地鼠肝脏组织TLR4 蛋白表达水平和TRAF-6 蛋白表达水平均显著下调（P＜0.05），且呈现剂量依赖性（P＜0.05）。见表3，图1。

3.4 理气化痰祛瘀方对高脂血症模型金黄地鼠肝脏组织TLR4 和TRAF-6 mRNA 表达水平的影响 与正常组比较，模型组金黄地鼠肝脏组织TLR4 和TRAF-6 mRNA 水平显著升高（P＜0.05）。与模型组比较，非诺贝特组金黄地鼠肝脏组织TLR4、TRAF-6 水平显著下调（P＜0.05）。与模型组比较，理气化痰祛瘀方低、中、高剂量组金黄地鼠肝脏组织TLR4、TRAF-6 水平显著下调（P＜0.05），且呈现剂量依赖性（P＜0.05）。见表4。

4 讨论

目前临床上常用他汀类药物作为防治心血管疾病的一线药物，但许多患者对他汀类药物治疗具有耐药性，最终仍死于心肌梗死或中风[5]。与西药相比中药虽然治疗高脂血症机制复杂，但不良反应较少。中医认为，高脂血症主要由痰瘀痹阻、脏腑功能不足形成，强调肝脾失调是该病的病理基础，痰瘀是其病变之标，多采用具有祛痰化瘀、升清降浊、补气活血功效的中药进行治疗[6-7]。理气化痰祛瘀方由浙江中医药大学附属第一医院陈芝芸教授临床验方演变而来，由桃仁、山楂、郁金、泽泻、海藻、象贝、香橼、莱菔子、茯苓组成，其中生山楂祛瘀消积；茯苓、泽泻除水湿，消痰浊；桃仁破血逐瘀，与泽泻配用，分流疏导，使邪有退路；郁金、香橼疏肝利胆，行气消痰；海藻、象贝化痰软坚散结，以助痰瘀的消除。诸药合用，痰、湿、瘀、积得除，肝脾功能得调，气血壅滞得通，该方经过临床辨证加减，对治疗高脂血症有明显的疗效。

表1 给药第6 周对高脂血症模型金黄地鼠血脂水平的影响（mmol/L，）

表1 给药第6 周对高脂血症模型金黄地鼠血脂水平的影响（mmol/L，）

注：正常组和模型组予等量0.9%生理盐水灌胃；非诺贝特组予非诺贝特悬液150mg·kg-1·d-1 灌胃；理气化痰祛瘀方低、中、高剂量组分别予依次剂量为6.3、12.6、25.2g·kg-1·d-1 灌胃；TC 为总胆固醇；TG 为三酰甘油；LDL-c 为低密度脂蛋白胆固醇；HDL-c 为高密度脂蛋白胆固醇；与正常组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与理气化痰祛瘀方低剂量组比较，cP＜0.05；与理气化痰祛瘀方高剂量组比较，dP＜0.05；与理气化痰祛瘀方中剂量组比较，eP＜0.05

表2 理气化痰祛瘀方对高脂血症模型金黄地鼠血清IL-6、TNF-α 及肝脏组织CYP7A1 含量的影响（）

表2 理气化痰祛瘀方对高脂血症模型金黄地鼠血清IL-6、TNF-α 及肝脏组织CYP7A1 含量的影响（）

注：正常组和模型组予等量0.9%生理盐水灌胃；非诺贝特组予非诺贝特悬液150mg·kg-1·d-1 灌胃；理气化痰祛瘀方低、中、高剂量组分别予依次剂量为6.3、12.6、25.2g·kg-1·d-1 灌胃；IL-6 为白细胞介素-6；TNF-α 为肿瘤坏死因子α；CYP7A1 为胆固醇7α 羟化酶；与正常组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与理气化痰祛瘀方低剂量组比较，cP＜0.05；与理气化痰祛瘀方中剂量组比较，dP＜0.05

表3 理气化痰祛瘀方对高脂血症模型金黄地鼠肝脏组织TLR4 和TRAF-6 蛋白表达水平影响（）

注：正常组和模型组予等量0.9%生理盐水灌胃；非诺贝特组予非诺贝特悬液150mg·kg-1·d-1 灌胃；理气化痰祛瘀方低、中、高剂量组分别予依次剂量为6.3、12.6、25.2g·kg-1·d-1 灌胃；TLR4 为Toll 样受体4；TRAF-6 为肿瘤坏死因子受体相关蛋白6；β-Actin 为β 肌动蛋白；与正常组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与理气化痰祛瘀方低剂量组比较，cP＜0.05；与理气化痰祛瘀方中剂量组比较，dP＜0.05

表4 理气化痰祛瘀方对高脂血症模型金黄地鼠肝脏组织TLR4 和TRAF-6 mRNA 水平的影响（）

表4 理气化痰祛瘀方对高脂血症模型金黄地鼠肝脏组织TLR4 和TRAF-6 mRNA 水平的影响（）

注：正常组和模型组予等量0.9%生理盐水灌胃；非诺贝特组予非诺贝特悬液150mg·kg-1·d-1 灌胃；理气化痰祛瘀方低、中、高剂量组分别予依次剂量为6.3、12.6、25.2g·kg-1·d-1 灌胃；TLR4 为Toll 样受体4；TRAF-6 为肿瘤坏死因子受体相关蛋白6；β-Actin 为β 肌动蛋白；与正常组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与理气化痰祛瘀方低剂量组比较，cP＜0.05；与理气化痰祛瘀方中剂量组比较，dP＜0.05

文献表明，脂肪细胞中LPS 作为TLR4 主要配体，可以激活TLR4/NF-κB 信号通路，诱导炎症发生，而TRAF-6 作为TLR4 信号通路中最重要的一环，在促炎及凋亡过程中发挥重要作用[8-9]。我们前期研究证明，理气化痰祛瘀方能有效降低高脂血症模型金黄地鼠血清血脂水平，TC、TG、LDL-c 含量下降程度高低依次为理气化瘀方中、高、低剂量组，并在一定程度上能改善高脂血症金黄地鼠肝脏病理变化程度[10]；实验还证明，其在一定程度上能恢复高脂血症金黄地鼠肠道菌群紊乱，改善菌群失衡，重新形成稳定的细菌菌群结构[4]；理气化痰祛瘀方能有效降低高脂血症金黄地鼠血清IL-6、TNF-α 含量（P＜0.05），其肝脏组织CYP7A1 含量则显著上升（P＜0.05），提示理气化痰祛瘀方可以有效减少IL-6、TNF-α 等炎症因子的分泌，改善大鼠肝组织的炎症程度，提高机体对脂质的消化吸收及对胆固醇的代谢作用。故笔者认为理气化痰祛瘀方能有效干预金黄地鼠高脂血症发生和发展，对治疗高脂血症有着积极的意义。

TLR4 作为介导先天免疫和炎症反应的主要受体，激活后通过髓样分化蛋白88（MyD88）依赖性途径介导炎症反应，导致NF-κB 活化促炎细胞因子（TNF-α、IL-6 等）分泌，与肝内脂肪堆积形成脂肪变性导致的肝组织受损共同形成脂肪性肝炎[11-12]。本实验发现，高脂血症模型金黄地鼠在理气化痰祛瘀方用药干预后显著抑制TLR4、TRAF-6 蛋白水平及mRNA 的高表达（P＜0.05），但对下游依赖途径信号转导通路其他炎性因子IL-1、TGF-B、p40 以及Toll 样受体相关分子（TRAM）和由B 干扰素TIF 结构域衔接蛋白（TRIF）联接的非依赖性通路发挥的影响作用还无法确定。因此，在摄入高脂或高能量饮食后血浆LPS 水平明显增加后，是否可以通过抑制TLR4 信号通路及其下游信号转导通路元件等相关促炎因子表达，在治疗高脂血症中发挥作用的确切机制尚需进一步研究。