安乃近代谢产物4-乙酰氨基安替比林的水生急性毒性研究

刘敏，殷浩文，王绿平，王樱芝，沈璐,朱慧

上海市检测中心生物与安全检测实验室，上海 201203

安乃近具有较强的解热镇痛功效，很长一段时间内大量用于临床治疗。但是该药具有较严重的毒副作用，比如，再生性贫血等，逐渐退出临床用药。发达国家如美国等禁止该药用于食源性动物中。欧盟规定其在肌肉中的限量为200 μg·kg-1[1]。在我国，安乃近由于价格低廉，仍大量用于猪、牛等食源性动物疾病防控。2002年，我国也将其列入限制清单，规定其在食源性动物组织中的限量为200 μg·kg-1[2]。

安乃近具有快速水解特性，水解产物4-甲氨基安替比林(MAA)，安乃近的药理作用主要通过MAA产生。MAA的代谢产物主要为4-甲酰氨基安替比林(FAA)和4-氨基安替比林(AA)，AA继续代谢，并最终代谢为4-乙酰氨基安替比林(4-AAA)[3]。早在1967年，Banerjee等[4]发现奶牛的血浆和尿液中存在大量的4-AAA。Martínez-Piernas等[5]发现废水中4-AAA浓度高达1.46 μg·L-1。采用此废水浇灌的萝卜和莴笋中的浓度为0.08～1.13 ng·g-1。Wiegel等[6]在欧洲中部的Elbe河中普遍检测出高水平的4-AAA，其最高浓度达939 ng·L-1。笔者之前的研究也发现，在上海市水源中，4-AAA浓度高达344 ng·L-1[7]。

然而，目前缺乏有关4-AAA的生态毒性报道，无法对其生态风险进行评估。为此本研究采用经济合作与发展组织(OECD)标准测试方法，从3个营养级水平，选取典型试验生物藻、大型溞和鱼，对其毒性效应进行评估，为后续生态风险评估提供数据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 仪器与试剂

电子分析天平(Mettler Toledo AL204，梅特勒-托利多集团，瑞士)，电子分析天平(Mettler Toledo ME204E/02，梅特勒-托利多集团，瑞士)，智能光照空气恒温振荡器(TS-211GZ，常州恒隆仪器有限公司，中国)，细胞颗粒计数器(Casy TT，Innovatis公司，德国)，手持式pH计(HANNA HI98128，哈纳公司，意大利)，照度计(KIMO LX100，凯茂公司，法国)，偏光显微镜(Zeiss Axio Scope.A1，卡尔蔡司公司，德国)，溶解氧测定仪(Oxi7310，WTW公司，德国)，超高效液相色谱仪(Waters AcquityTMH-class/PDA eλDetection，沃特世公司，美国)，恒温水浴槽(自制)。4-乙酰氨基安替比林，纯度97%，购自百灵威(中国)；甲醇为色谱级，购自西格玛公司；其余试剂均为分析纯，购自国药集团。

1.2 试验生物

近头状伪蹄形藻引自中国科学院水生生物研究所。藻在实验室培养，试验前，在试验条件下培养藻细胞3 d，试验开始时，藻细胞处于对数生长期，浓度为1.09×106个·mL-1。2018年6月1日，用参比样品重铬酸钾进行质量控制试验，得72 h-ErC50值为1.00 mg·L-1(0.92～1.28 mg·L-1)，在可接受范围之内((1.10±0.48) mg·L-1)[8]。

大型溞原种是引自MicroBioTests Inc.的大型溞休眠卵。试验用大型溞为实验室自行繁育的大型溞，经孤雌繁殖后所得的是溞龄小于24 h的非头胎幼溞。其各世代大型溞均饲养于Elendt M4中，投喂栅藻(Desmodesmussubspicatus)和近头状伪蹄型藻(Pseudokirchneriellasubcapitata)，每日一次，每个成体每日0.1～0.2 mg有机碳。2018年9月，用参比样品重铬酸钾进行质量控制试验。重铬酸钾的24 h-EC50为1.42 mg·L-1，在可接受的范围内(0.6～2.1 mg·L-1)[9]。

稀有鮈鲫(Gobiocyprisrarus)由上海市检测中心生物与安全检测实验室自行繁育。试验鱼在试验条件下已驯养14 d以上。驯养条件为：活性炭过滤、紫外灭菌的自来水，同时也用作试验用水；21～25 ℃，变化不超过2 ℃；pH范围为6.0～8.5；溶解氧浓度>80% ASV(即大于空气中饱和氧含量的80%)；光照周期L∶D=12 h∶12 h；每天喂食丰年虾薄片，试验开始前24 h停止喂食。驯养期间未发现疾病。试验开始前7天内试验鱼死亡率为0%。2018年6月，用参比样品重铬酸钾进行质量控制试验。重铬酸钾对稀有鮈鲫的96 h-LC50值为257 mg·L-1(95%置信限为207～309 mg·L-1)，在实验室内部质量控制的标准之内(82.2～310 mg·L-1)。

1.3 急性毒性试验

4-AAA的水生急性毒性通过藻类生长抑制试验[10]、大型溞活动抑制试验[11]以及鱼类急性毒性试验[12]进行评估。

1.3.1 溶液制备

称取一定量的样品直接溶解于各试验用水中，避光连续磁力搅拌72 h，产生漩涡高度为样品液柱高度的1/3，经0.45 μm硝酸纤维素膜过滤后配制成浓度为1 500 mg·L-1或3 000 mg·L-1的样品母液。用试验用水稀释样品母液，配制成各浓度的试验溶液。

1.3.2 藻类生长抑制试验

预试验结果表明，1 500 mg·L-14-AAA暴露条件下，未观察到明显的生长抑制现象；因此，以1 500 mg·L-1的配制浓度进行限度试验，试验溶液体积100 mL，每组设6个平行。以藻类培养液作为空白对照组，设6个平行。藻细胞初始浓度约为104个·mL-1，试验持续72 h。试验条件为：22.8～23.1 ℃；培养基表面保持连续光照，光照强度4 988～5 554 lux；0 h和72 h，试验溶液pH范围分别为8.01～8.02和9.12～9.16。在试验开始后0、24、48和72 h，从各样品组中选取1个容器，从中各取2 mL试验溶液用于浓度分析。试验开始后0、24、48和72 h，对各试验容器内的藻类数量和形态进行测定。

1.3.3 溞类急性运动抑制试验

预试验结果表明，1 000 mg·L-1的4-AAA对大型溞的活动存在明显抑制；因此，开展系列浓度暴露的正式试验。试验开始前测得样品母液(3 000 mg·L-1)pH值为6.78，不需要调节pH。用Elendt M4稀释样品母液，配制成各浓度试验溶液。试验设置1个空白对照组和5个暴露组，暴露组的配制浓度分别为188、375、750、1 500和3 000 mg·L-1。各组均设置4个平行，各平行试验样品体积为250 mL，试验持续48 h，试验方式为静态。试验用水硬度为145 mg·L-1；pH值6.68～7.01；温度20.1～20.5 ℃；溶解氧浓度7.03～8.31 mg·L-1；光照周期L∶D=16 h∶8 h；每个平行5只溞，试验期间不饲喂。在0、24和48 h分别观察并记录试验幼溞的活动抑制数。在试验开始和结束时从空白对照组和样品组各选取1个容器分别取20 mL试验溶液进行样品浓度分析。

1.3.4 鱼类急性毒性试验

预试验结果表明，1 500 mg·L-1暴露条件下，鱼未发生死亡现象。以1 500 mg·L-1的配制浓度进行限度静态试验，试验溶液体积4 L。同时设置空白对照组，不设平行。在每个试验组容器中分别放入10尾试验鱼，试验持续96 h，试验期间不喂食。承载量约0.5 g·L-1(以鱼体质量计)。温度21.8～22.4 ℃；光照周期L∶D=12 h∶12 h；溶解氧为84.4%～91.2% ASV；pH 7.03～7.57。试验开始和结束，分别从暴露组和空白组各取2 mL试验溶液用于浓度分析。试验结束时，试验鱼体长为(2.4±0.1) cm(Mean±SD)，体重为(0.24±0.04) g(Mean±SD)。

1.4 化学分析

采用超高效液相色谱对试验溶液进行分析。首先对各试验介质进行系统的方法验证，主要包括线性范围、回收率、精密度、检测限和定量限。试验开始和结束时，样品测试中均添加加标样品进行质量控制。分析条件如下：色谱柱为BEH C18(2.1 mm×50 mm, 1.7 μm)；检测波长为257 nm；流动相流速0.4 mL·L-1，流动相为甲醇(A)和水(B)，梯度洗脱程序为初始比例V甲醇∶V水=98∶2，保持0.5 min，2 min内甲醇含量增加到30%，保持3 min，0.5 min之内回到起始点并平衡1.5 min。

1.5 数据统计

采用t-Test比较样品组与空白对照组之间的平均特定生长率和生长量的差异，从而获取无可观察效应浓度(NOEC)和最低可观察效应浓度(LOEC)值。采用Maximum Likelihood-Probit进行浓度效应拟合，计算效应浓度(ECx)。数据分析用软件Toxcalc v5.0.32完成。

2 结果与讨论(Results and disscussion)

2.1 浓度分析

对藻、溞和鱼试验各试验基质中的分析方法均经过系统的方法验证。线性范围为0.0535～1.07 mg·L-1，线性方程为Y=1.07×104X+33.8，相关系数为0.9999。空白均不存在干扰，0.0642 mg·L-1和0.856 mg·L-1藻、溞和鱼基质加标样品的回收率分别为97.0%和96.3%、95.6%和95.1%、98.1%和99.5%；对应的精密度分别为1.49%和0.46%、0.84%和0.33%、1.30%和0.58%。方法检测限和定量限均为0.0268 mg·L-1和0.0535 mg·L-1。质量控制样品的回收率为99.8%～104%。

藻类抑制试验、大型溞活动抑制试验和鱼类急性毒性试验中，各试验溶液的样品实测浓度与配制浓度偏差均小于20%，分别-2.47%～2.80%、-8.27%～0.00%和2.00%～2.13%(表1)。

2.2 毒性效应

2.2.1 藻类生长抑制效应

空白对照组藻细胞浓度从1×104个·L-1增加到1.14×106个·L-1，增加至114倍(表2)；平均特定生长率1.58 d-1，空白对照组各时间段特定生长率的变异系数平均值为19.7%(表3)；整个试验期间，空白对照组各平行的平均特定生长率的变异系数为2.31%。整个试验满足OECD 201质量控制要求[10]。

暴露组藻细胞浓度从1×104个·L-1增加到1.10×106个·L-1，增加至110倍；跟对照组相比，生长量抑制率为-13.5%～13.7%(表2)。平均特定生长率1.59 d-1，空白对照组各时间段特定生长率的变异系数平均值为17.6%；跟空白对照组进行比较，特定生长率抑制率为-2.53%～3.16%，平均抑制率仅为0.63%(表3)。统计结果表明，4-AAA对近头状伪蹄形藻(Pseudokirchneriellasubcapitata)的72 h生长抑制效应，若以平均特定生长率和生长量表示，72 h-NOEC均≥1 502 mg·L-1，LOEC、EC10及EC50均>1 500 mg·L-1。

2.2.2 大型溞活动抑制效应

试验结束时，空白对照组大型溞活动受抑制率为0%，试验溶液的溶解氧浓度最低值为7.62 mg·L-1。满足OECD 202试验所有质控要求[11]。

整个试验过程中，375 mg·L-1及以下浓度组在试验期间未观察到明显的活动抑制。但24 h后，750 mg·L-14-AAA暴露组，3只大型溞出现活动抑制，1 500 mg·L-1的暴露组，抑制数量达到11只，而最高暴露组中，80%的大型溞的运动能力明显受到抑制。暴露48 h后，抑制率明显增加，750 mg·L-1组，运动能力受抑制的数量增加到8只，而1 500 mg·L-1和3 000 mg·L-1暴露组的抑制率分别达到70%和95%(图1)。

图1 不同4-乙酰氨基安替比林(4-AAA)暴露浓度下大型溞的活动抑制率Fig. 1 Mobility inhibition rate of daphnia when exposed to different concentrations of 4-acetamidoantipyrine (4-AAA)

表1 样品的浓度分析结果Table 1 The results of samples analysis

表2 72 h内藻的生长量Table 2 Yield of alga in 72 h

浓度效应拟合曲线(图2)分析结果表明，对大型溞(Daphniamagna)活动抑制的24 h-EC50值为1 538 mg·L-1，95%置信区间为1 217～2 017 mg·L-1；48 h-EC50值为1 041 mg·L-1，95%置信区间为834～1 304 mg·L-1。

2.2.3 鱼类急性致死效应

试验结束时，空白对照组鱼无死亡现象。试验溶液的溶解氧为79.1%～91.3% ASV。满足OECD 203试验所有质控要求[12]。

试验过程中，暴露组试验鱼均未出现死亡和异常行为。试验溶液中样品实测浓度的几何平均值为1 531 mg·L-1。因此，4-AAA对鱼类无急性毒性，96 h-LC50为≥1 531 mg·L-1。

Zhou等[13]采用ECOSAR软件估算其对藻和鱼的急性毒性，测算得到的EC50和LC50分别为2.53 mg·L-1和6.05 mg·L-1。这可能是由于ECOSAR数据库中与4-AAA结构类似的化合物数据较少，导致预测结果偏差较大。Gong等[14]的研究表明，其母体化合物安替比林及其催化降解产物对普通小球藻(Chorellavulgaris)在1～50 μmol·L-1范围内没有抑制效应。另外，催化降解过程中，随着安替比林的降解，对丰年虾(Artemiasalina)的致死效应降低。这表明，其降解产物毒性下降。

2.3 分类及风险评估

根据全球化学品统一分类和标签制度(GHS)分类[15]，急性毒性终点>100 mg·L-1，无明显急性毒性，急性毒性不归类。根据欧盟风险评估导则，获得3个急性毒性数据的情况下，风险评估因子为1 000[16]。选取急性毒性最大的终点值，即大型溞活动抑制的48 h-EC50为1 041 mg·L-1，由此计算4-AAA的预计无效应浓度(PNEC)为1.04 mg·L-1。其类似物4-甲基氨基-安替比林的PNEC为961 μg·L-1[17]。笔者列出了国内外地表水中4-AAA的浓度(表4)。将地表水的测试浓度除以PNEC得到风险商值(RCR)。由表4可知，我国地表水中由4-AAA引起的风险值处于较低水平。尽管欧洲污水受纳河中4-AAA高达3 675 ng·L-1，其最大风险值为3.53×10-3，表明风险较低。由此判断，水中4-AAA污染引起的生态风险较低。北京的生活污水处理厂的出水中4-AAA浓度达1 300～2 240 ng·L-1[18]。西班牙的污水处理厂出水中4-AAA更是高达25 μg·L-1[19]。Shao等[20]采用Toolox软件计算的方法筛选基因毒性化合物，认为4-AAA具有潜在的基因毒性。同时检测出基因毒性的地表水中也鉴别出了4-AAA。因此，尽管从现有的测试数据来看，生态风险较小，但仍需关注其对地表水的影响。因为，现有的生态毒性数据有限，评估存在较大的不确定性，后续需关注其慢性毒性。

表4 地表水中4-AAA的风险评估Table 4 Risk assessment of 4-AAA in surface water