紫毛野牡丹提取物抑真菌活性研究

王智宇，刘东，刘侠，杨卫丽

海南医学院药学院，海南 海口 571199

紫毛野牡丹(Melastoma genicillatumNaud.)归属于野牡丹科(Melastomaceae)野牡丹属(Melastoma)，《中国植物志》记载其国内仅分布于海南省，国外菲律宾亦有分布[1]。现有研究中已经发现，其同科属的植物具有一定的药用开发价值[2-7]，例如野牡丹属中的野牡丹等植物具有治疗霍乱、腹泻、持续性发热、痢疾、白带、创伤、皮肤病等作用；在金色葡萄球菌、伤寒杆菌、绿脓杆菌及溶血性链球菌等微生物的药敏试验中，显示出显著地抑制作用。紫毛野牡丹作为野牡丹属植物之一，其药理作用未见报道，故本文对其提取物抑菌作用进行初步的研究，为紫毛野牡丹及其同属植物的研究奠定一定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 植株于2017 年5 月采自海南省屯昌县，经形态学鉴定确为野牡丹属植物紫毛野牡丹。晾干，40℃鼓风干燥，粉碎，过60 目筛，用密封袋包装扎紧，干燥器贮藏，备用。白假丝酵母菌(Candida albicans，Ca)、热带假丝酵母菌(Candida tropicalis，Ct)、光滑假丝酵母菌(Candida glabrata，Cg)、克柔假丝酵母菌(Candida kruseis，Ck)、近平滑假丝酵母菌(Candida parapsilosis，Cp)，由海南医学院科学实验中心提供。

1.2 仪器 YJ-VS 型超净工作台，CASCADA LS MK2 型超纯水系统，SPR2NG-R30 型台式可挂壁纯水器，HH·CP-01型二氧化碳培养箱，GR60DR型全自动立式高压灭菌器，Tanon-4100型全自动数码凝胶图像分析系统，SynergyHTX 型多功能酶标仪，DHG-9123A 型电热恒温鼓风干燥箱，赛多利斯BS210S型电子天平，HYQ-2121型涡旋混匀器。

1.3 提取方法 称取药材粉末100 g，超纯水1 000 mL浸泡2 h，加沸石数粒，煮沸2 h，过滤，滤渣加500 mL超纯水，煮沸2 h，过滤，合并滤液，蒸干，得干膏，计算得率，干膏置于4℃冰箱储存备用；另再称取药材粉末100 g，70%乙醇1 000 mL浸泡2 h，加沸石回流2 h，过滤，滤渣再次加入500 mL 70%乙醇，回流2 h，过滤，合并滤液，回收至干膏，干膏置于4℃冰箱储存备用。

1.4 MH 琼脂培养基的制备 称取MH 琼脂36.0 g，溶解于1 000 mL 超纯水中，121℃高压灭菌15 min，冷至50℃～60℃，倾入无菌培养皿，放冷置4℃冰箱保存备用；另取20.0 g 葡萄糖与MH 琼脂一同溶解于1 000 mL超纯水中，121℃高压灭菌15 min，冷至50℃～60℃，倾入无菌培养皿，制成含2%葡萄糖的MH琼脂培养基，放冷置4℃冰箱保存备用。

1.5 工作用菌的准备 取各供试菌菌种，划线于2%葡萄糖的MH琼脂培养基平面第一次活化，置37℃培养箱培养48 h 后刮取单菌落划菌于2%葡萄糖的MH 琼脂培养基平面进行二次活化，置37℃培养箱培养培养48 h后作为工作用菌，置4℃冰箱保存备用。

1.6 菌悬液的配制 采用麦氏比浊法，量取1%硫酸溶液4.9 mL和0.5%氯化钡溶液0.1 mL，分别加入试管充分混匀，制成0.5#麦氏比浊管，用时新制；刮取工作用菌落，加无菌生理盐水配制成与0.5#麦氏比浊管浊度相近的溶液，即得近似浓度为1.5×108CFU/mL的菌悬液，用时新制。配制均在无菌条件下进行。

1.7 纸片扩散法抑菌试验

1.7.1 试液的准备 根据预试验结果，称取水提干膏和70%乙醇提干膏，分别溶解于40.0 mL 超纯水中摇匀，配制成按原药量计算浓度为0.25 mg/mL的药液，作为各提取的抑菌溶液，置于4℃冰箱中贮存，备用。再精密称取氟康唑0.025 0 g 置10 mL 容量瓶中，超纯水溶解并定容，得2.5 mg/mL 的氟康唑对照品药液，4℃冰箱贮存，备用。

1.7.2 纸片的制备 将粗滤纸制成直径6 mm 的圆型纸片，置西林瓶中，封口121℃高压灭菌20 min，干燥，密封保存。

1.7.3 试验内容 试验分为四组，分别为氟康唑溶液阳性对照组、超纯水空白组、紫毛野牡丹水提取物组、紫毛野牡丹70%乙醇提取物组。无菌条件下，取MH琼脂培养基加菌悬液300µL，涂布均匀，吸出多余菌液，放置片刻，夹取圆形纸片，展平，置于培养皿中央，轻轻按压，吸取药液10µL 滴加于纸片中央，盖上培养皿，做好标记，37℃培养，48 h 后观察并记录抑菌圈直径，每组三个平行样。

1.8 微量稀释法抑菌试验

1.8.1 RPMI-1640 培养基的制备 分别称取10.4 g RPMI-1640，34.5 g MOPS，2.0 g NaHCO3，置1 000 mL 容量瓶中，加超纯水适量使溶解，以1 mol/L NaOH 调节培养基pH 至7.0±0.1，超纯水定容至刻度。无菌条件下，以0.22µm 微孔滤膜滤过，置4℃冰箱中保存，备用。

1.8.2 试液的准备 用时新制，分别精密称取紫毛野牡丹水提物干膏及70%乙醇提取物干膏，按生药量计算，分别以超纯水配制成4 096µg/mL的药液，高压灭菌后分别用RPMI-1640 液体培养基进行对倍稀释配制，得浓度分别为2 048 µg/mL、1 024 µg/mL、512 µg/mL、256µg/mL、128µg/mL、64µg/mL、32µg/mL、16µg/mL、8µg/mL、4µg/mL 的药液；再精密称取氟康唑对照品以超纯水配制成浓度为1 024µg/mL的药液，高压灭菌后用RPMI-1640 液体培养基对倍稀释得浓度分别为512µg/mL、256µg/mL、128µg/mL、64µg/mL、32µg/mL、16µg/mL、8µg/mL、4µg/mL、2µg/mL、1µg/mL的氟康唑药液，放入离心管架中，置4℃冰箱保存备用。

1.8.3 试验内容 菌悬液分两步稀释1 000 倍作为试验用菌液，试验设置分为氟康唑阳性对照组、水提物组、70%乙醇提取物组、空白组及阴性对照组，无菌条件下，取96 孔板按组别分别加入相应溶液，其中氟康唑组、水提物组及乙醇提取物组分别加入先前配制好的相应药液100µL及100µL试验用菌液，空白组加入200µL RPMI-1640液体培养基，阴性对照组加入100µL RPMI-1640液体培养基及100µL试验用菌液，加好药液和菌液后，适度振摇均匀，多功能酶标仪波长450 nm 测定，记录数据为空白吸光度，放入37℃培养箱中培养48 h 后再进行测定，记录数据为培养48 h后吸光度，计算MIC值。

1.8.4 最低抑菌浓度(MIC)以培养48 h 后各孔吸光度减去对应空白板各孔吸光度得差值，将阴性对照组的平均差值计为100%的生长率，其值的1/2 计为50%的抑制率，实验组中平均差值最接近50%抑制率的对应浓度计为该药液的MIC值。

2 结果

2.1 纸片法抑菌试验结果 纸片法考察紫毛野牡丹水提取物及70%乙醇提取物的对各供试菌的抑制作用，所得结果见表1。纸片法试验结果表明，紫毛野牡丹水提取物及70%乙醇提取物对五种假丝酵母菌均具有敏感性，对Ck表现出中度敏感性，对其他四种酵母菌(Ca、Ct、Cg、Cp)表现为低敏感性；而其70%乙醇提取物对Cg及Cp表现出了高度敏感性，对另外三种酵母菌(Ca、Ct、Ck)表现为中度敏感性。

2.2 微量稀释法试验结果 微量稀释法考察紫毛野牡丹水提取物及70%乙醇提取物的对各供试菌的MIC值，所得结果见表2。微量稀释法试验结果表明，紫毛野牡丹水提物对五种假丝酵母菌均具有抑制作用，其中对Ca及Cg的MIC值为32 µg/mL，对Ct及Cp的MIC值为128µg/mL，而对Ck的MIC 值为256µg/mL；而其70%乙醇提取物对五种假丝酵母菌亦具有抑制作用，其中对Ca及Cg的MIC 值为32 µg/mL，对Ct的MIC 值为64µg/mL，而对Ck及Cp的MIC值为128µg/mL。

表1 纸片法抑菌试验结果(抑菌圈直径：mm)

表2 紫毛野牡丹水提物的MIC值(g/mL)

3 讨论

目前念珠菌属作为常见的真菌感染类型，临床治疗主要使用化学药品进行治疗，但这往往会产生耐药性、不良反应多等问题，使真菌感染的治疗变得越来越困难[6-9]。

从药用植物中寻找抗菌药物已有多年的历史[10-12]。本实验对紫毛野牡丹采用水和70%乙醇两种溶剂进行提取，分别对提取物进行了体外抗念珠菌属实验，根据预实验结果确定了本次实验需要的药液浓度。在抑菌活性分析时采用纸片法，参照《微生物学检验技术》判定结果，抑菌圈直径小于10 mm 为钝敏，10～15 mm 为低度敏感，15～20 mm 为中度敏感，20 mm 以上为高度敏感。根据实验数据紫毛野牡丹水提取物及70%乙醇提取物对五种假丝酵母菌均具有敏感性，水提取物对Ck表现出中度敏感性，对其他四种酵母菌(Ca、Ct、Cg、Cp)表现为低敏感性；70%乙醇提取物对Cg及Cp表现出了高度敏感性，对另外三种酵母菌(Ca、Ct、Ck)表现为中度敏感性。从微量稀释法结果可知，紫毛野牡丹水提物和70%乙醇对Ca及Cg的菌株具有剂量依赖性敏感；与已有的研究成果对比，紫毛野牡丹提取物对念珠菌属真菌的抑制效果显著[13-16]。野牡丹属植物有关研究中显示，其属主要含有的黄酮类和鞣酸类成分为其属植物的特征性成分及活性成分[17]，而紫毛野牡丹化学成分研究未见报道，故在未来的研究中会对其主要抑菌活性成分及抑菌机制进一步研究，从而阐明其抑制真菌机制及活性成分，为该植物的研究开发奠定一定基础。