功能菌对曲霉型豆豉风味物质形成的影响

于华，刘亚君，梅小庆，赵佳丽，张红，陈梦媛

(1.四川工业科技学院 食品学院，四川 德阳 618500；2.四川工业科技学院 电子信息与计算机工程学院，四川 德阳 618500)

豆豉是以黑豆或黄豆为原料，利用微生物发酵制成的一种具有独特风味的中国民族特色的传统发酵食品。近些年来，其保健功能引起了研究者及消费者的高度关注[1]。已有的研究结果表明，豆豉具有良好的抗氧化性、降血压和抗糖尿病等功能特性[2]。同时，豆豉中风味物质的形成机制历来备受关注，其风味来源主要是微生物在豆豉中生长分泌的各种酶，降解了豆中的蛋白质、淀粉等大分子物质，水解后的次级代谢产物之间又经过一系列复杂的生化反应，从而生成独特的风味物质[3]。

豆豉中风味物质的研究，前期依靠人的感官对其进行评判，但由于人的主观因素该方法最终被淘汰。随着科技的发展出现了顶空固相微萃取-气质联用法和高效液相色谱法，更快速、方便、准确地测定食品中的风味物质[4]。豆豉中风味物质的分析主要为测定有机酸、挥发性物质和游离氨基酸。近年来对豆豉中挥发性物质和功能性物质的研究越来越多，但大多是对豆豉风味物质的简单检测，对于豆豉混菌发酵中各功能菌的相互作用影响风味以及豆豉中各风味物质贡献作用的研究较少。

本文对传统的米曲霉型制曲工艺进行改进，在人工接种米曲霉的基础上，又添加了异常威克汉姆酵母、乳酸片球菌和产酸芽孢杆菌等功能菌，以及不同配比，最终分析各种功能菌和功能菌相互作用对米曲霉型豆豉风味物质的影响。本研究对今后米曲霉型豆豉制作工艺的改进、功能菌以及风味物质的确定有重要的指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原材料

黄豆：购于超市，成都人民营养食品厂；米曲霉孢子：石家庄市鼎鑫酿造食品科学研究所；异常威克汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)和产酸芽孢杆菌(Bacillusacidiproducens)：学院实验室提供。

试剂：甲醛、酵母膏、蛋白胨、葡萄糖、琼脂、磷酸氢二钾、柠檬酸氢二铵、无水乙酸钠、硫酸镁、牛肉膏、亚铁氰化钾、硫酸锌、氢氧化钠、氯化钠、邻苯二甲酸氢钾、磷酸氢二铵、磷酸等，以上药品均为分析纯；琥珀酸、草酸、酒石酸、甲酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸、丙酸、乙酸，以上药品均为色谱纯。

1.1.2 培养基

MRS培养基、YPD培养基。

1.1.3 仪器与设备

GZ-250-HS Ⅱ恒温培养箱；SW-CJ-IFD洁净工作台；GR60DF立式自动压力蒸汽灭菌锅；BH200生物显微镜；CP214电子天平；DZKW-4电子恒温水浴锅；DHG-9075A电热恒温鼓风干燥箱；Starter 2C实验室pH计；78HW-1恒温磁力搅拌器；超声波清洗机；高效液相色谱仪；气相色谱-质谱联用仪；固相微萃取装置(包括手柄、导向杆、85 μm CAR-PDMS萃取纤维头)。

1.2 试验方法

1.2.1 功能菌菌悬液的制备[5]

分别将实验室保藏的异常威克汉姆酵母、乳酸片球菌和产酸芽孢杆菌在相应的MRS平板培养基或YPD平板培养基上活化。将活化菌株接种于相应的平板培养基上培养至对数后期，用无菌生理盐水洗脱，使其浓度达到108CFU/mL，置于4 ℃冰箱中保存，备用。

1.2.2 豆豉制备[6]

浸豆：称取6份黄豆，每份100.0 g，将黄豆洗净，放入40 ℃的温水中恒温浸泡3.5 h(重量增加约2.1倍，豆粒胀起无皱纹)，放掉浸泡水，沥干。

蒸豆：把浸泡后沥干水分的大豆放至压力锅中，盖好锅盖，121 ℃蒸30 min，大豆蒸熟。

前发酵：将蒸熟的大豆拿出锅，冷却，添加功能菌，拌匀，放于30 ℃培养箱中培养，大豆的厚度约为3 cm，发酵12 h后每9 h翻一次，使每颗大豆都松散、不结块。

添加功能菌：第一份加入0.0300 g米曲霉，记为1号样；第二份加入0.0300 g米曲霉和2 mL异常威克汉姆酵母菌悬液，记为2号样；第三份加入0.0300 g米曲霉和2 mL乳酸片球菌菌悬液，记为3号样；第四份加入0.0300 g米曲霉和2 mL产酸芽孢杆菌菌悬液，记为4号样；第五份加入0.0300 g米曲霉、1 mL异常威克汉姆酵母菌悬液和1 mL乳酸片球菌菌悬液，记为5号样；第六份加入0.0300 g米曲霉和3种菌的混合菌悬液2 mL，记为6号样。

洗曲：用约50 ℃清水把豆豉成品表面的霉菌以及污物清洗干净，清洗4～6次，注意不要破皮。

后发酵：将大豆沥干(每份的质量大约为167 g，重量增加至干黄豆的1.67倍)，加入12.0 g食盐，拌匀，压实装罐密封，在37 ℃培养箱中进行后发酵，每隔2天测定其总酸和氨基酸态氮含量。

干豆豉：豆豉后发酵完成后，将豆豉放入真空干燥箱35 ℃干燥12 h，即为成熟豆豉。

1.2.3 豆豉中总酸的测定[7]

准确称取5.0000 g的豆豉用研钵磨碎，加适量的蒸馏水，浸泡3 h，转移至100 mL容量瓶中并定容，摇匀，过滤，去其初滤液(20 mL左右)，取滤液20 mL于烧杯中，按GB/T 5009.39-2003中4.2.1.4从“置于200 mL烧杯中加入60 mL水……可计算总酸含量”依次操作。计算参照GB/T 5009.39-2003中4.4.5。

1.2.4 豆豉中氨基酸态氮的测定

取上述滤液20 mL于烧杯中，按GB/T 5009.39-2003中4.2.1.4自“置于200 mL烧杯中加入60 mL水……”起依次操作。同时做空白试验，计算参照GB/T 5009.39-2003中4.2.1.5。

1.2.5 豆豉中有机酸的测定

1.2.5.1 样品处理

准确称取磨碎的2.5 g豆豉，研磨后转入到100 mL离心管中，加入50 mL超纯水，于超声波清洗机中提取30 min，温度为60 ℃，使有机酸充分浸出，冷却后4000 r/min离心20 min，将上清液转移到100 mL的容量瓶中，残渣加入25 mL超纯水再提取，合并上清液，加入2 mL的10.6%亚铁氰化钾溶液和2 mL的30%硫酸锌溶液沉淀蛋白，用超纯水定容至刻度，摇匀，静置30 min。吸取上清液用0.45 μm滤膜过滤，滤液供HPLC检测[8]。

1.2.5.2 色谱条件[9,10]

色谱柱：Agilent ZORBAX-SB-Aq(4.6 mm×250 mm，5 μm)；检测器：二极管阵列检测器；流动相A为0.5%磷酸氢二铵，并用H3PO4调节pH为2.5，流动相B为甲醇，流动相A∶流动相B为95∶5；流速为0.400 mL/min；检测波长为210 nm；进样量为20 μL；柱温为30 ℃。

1.2.5.3 标准曲线绘制

准确称取各有机酸标准品0.2000 g(或0.2 mL)以超纯水溶解并定容至100 mL备用。分别吸取各标准混合母液，用超纯水稀释成0.500，0.200，0.100，0.020，0.010 mg/mL系列混合标准溶液。进样检测，分别测定不同标准品的出峰时间，及其不同浓度所对应的峰面积，与标准曲线对照定量计算。

1.2.5.4 样品测定

各待测样品处理后上机检测，记录数据，与标准曲线对照定量计算。

1.2.6 豆豉中挥发性风味物质的测定[11,12]

1.2.6.1 样品处理

取3 g豆豉样品磨碎，放入20 mL顶空瓶中，加入3 g NaCl，盖上密封垫和铝帽，密闭后于磁力搅拌器上在50 ℃加热平衡20 min后，将萃取头插入瓶中，推出纤维头，恒温吸附30 min，然后缩回萃取纤维头，插入气相色谱进样口解吸5 min。

1.2.6.2 色谱条件

色谱柱Rtx-5MS为非极性毛细管柱；载气为He，流速1.0 mL/min，不分流进样；程序升温：柱初温55 ℃保持1 min，升温速率：6 ℃/min，终温230 ℃保持5 min。电离方式：电子电离；电离能：70 eV；电压：350 V；接口温度：230 ℃；扫描范围：35～400 u。

2 试验结果与分析

2.1 功能菌对豆豉中总酸和氨基酸态氮合成的影响

2.1.1 功能菌对豆豉中总酸合成的影响

豆豉发酵的酸度会直接影响微生物的生长代谢及种类，对豆豉的品质好坏有一定的影响[13]。本试验在后发酵期间每隔3 d分别在6个豆豉样品中取样，然后用电位滴定法测定不同样品不同时期的总酸变化情况，见图1。

图1 总酸的变化趋势图Fig.1 Change trend chart of total acids’ content

由图1可知，豆豉在发酵过程中总酸一直呈增长趋势，前期较为迅速，后期缓慢，第7天后趋于稳定。发酵前期，营养物质丰富，微生物代谢较快，产生大量有机酸，总酸增长迅速；发酵后期，营养物质的消耗和有机酸的积累，发酵环境处于高酸性，低营养状态，从而导致微生物代谢缓慢，总酸含量增长缓慢。总酸最终含量分别为：1号样1.579 g/100 g，2号样1.904 g/100 g，3号样1.971 g/100 g，4号样1.791 g/100 g，5号样1.771 g/100 g，6号样1.504 g/100 g。由此可以看出，异常威克汉姆酵母菌和乳酸片球菌对总酸的贡献较大，其他菌体和混菌对总酸的促进作用不大。

2.1.2 功能菌对豆豉中氨基酸态氮合成的影响

在豆豉发酵过程中，氨基酸态氮含量可以反映蛋白质水解程度，其含量是反映豆豉是否成熟的重要指标，且氨基酸态氮是豆豉中主要鲜味作用的一种风味物质[14]。在每次测定总酸时，同时进行氨基酸态氮的测定，不同样品不同时期的氨基酸态氮变化情况见图2。

图2 后发酵过程中氨基酸态氮的变化趋势图Fig.2 Change trend chart of amino acid nitrogen content in the post fermentation process

由图2可知，豆豉在发酵过程中氨基酸态氮一直呈增长趋势，前期较为迅速，后期缓慢，第7天后趋于稳定，和总酸的变化趋势一样。由2图可知米曲霉型豆豉在制曲阶段额外加入功能菌并没有对后发酵时间造成影响，但是对豆豉中氨基酸态氮含量有一定的影响，最终含量分别为：1号样1.712 g/100 g，2号样1.900 g/100 g，3号样1.610 g/100 g，4号样1.470 g/100 g，5号样1.550 g/100 g，6号样1.326 g/100 g。由此可以看出，异常威克汉姆酵母菌对氨基酸态氮贡献最大，其他菌体和混菌均对其有抑制作用。且总酸和氨基酸态氮含量最低的都是6号样，可知并不是加入的功能菌种类越多，总酸、氨基酸态氮含量就越高，有可能是菌种之间相互影响，氨基酸转换成了其他物质。

2.2 功能菌对豆豉中有机酸合成的影响

2.2.1 标品有机酸标准曲线的绘制

标品为酒石酸、苹果酸、乳酸、冰乙酸、柠檬酸、草酸、甲酸、琥珀酸、丙酸9种有机酸，分别进行5个浓度梯度的有机酸混标检测，梯度为0.010～0.500 mg/mL，其中各有机酸标品浓度为0.500 mg/mL(或0.500 mL/mL)的高效液相色谱图见图3，各有机酸标准曲线见表1。

图3 有机酸混合标样的高效液相色谱图Fig.3 HPLC of organic acid mixing standard samples

由图3可以清晰地看到不同的时间段出现了9个峰，分别对应9种有机酸：草酸、酒石酸、苹果酸、甲酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、丙酸。

表1 9种有机酸标品测定的线性相关性Table 1 The linear correlation of the determination of 9 organic acid standard samples

将浓度在0.01～0.500 mg/mL(mL/mL)范围内的系列混标溶液进行HPLC分析，对各测得值进行相关系数分析和线性回归分析。结果表明：除乙酸的相关系数(R2)为0.929之外，其余的都大于0.990，说明各种有机酸组分的峰面积和有机酸组分浓度的线性相关性总体上很好，在误差允许范围内可以很好地测定有机酸的含量。

2.2.2 6个样品中有机酸测定的结果

6个样品中有机酸测定的结果见表2。

表2 6个样品中有机酸的比较Table 2 The comparison of organic acids’ content in 6 samples

由表2可知，总体上各功能菌对米曲霉型豆豉混菌发酵产生有机酸贡献不大，其中只有3号样的有机酸种类最多，与1号样相比，种类上多了一种甲酸；柠檬酸增加了约8.6倍；琥珀酸增加了约23.5倍，并且HPLC色谱图中还有12个峰的保留时间与标品不一致。2号样虽然与1号样的有机酸种类一样，但除酒石酸、苹果酸、琥珀酸之外，其余的有机酸含量均有所下降。4，5号样中有机酸的种类和含量都较少，6号样没有检测出标品有机酸。所以，3种功能菌中只有乳酸片球菌对米曲霉型豆豉混菌发酵产生有机酸的贡献最大。

2.3 功能菌对豆豉挥发性物质合成的影响

豆豉样品中挥发性风味物质检测结果见表3和表4。

表3 豆豉中挥发性风味成分含量Table 3 The content of volatile flavor components in fermented blank beans

续 表

表4 豆豉样品中挥发性物质种类的比较Table 4 The comparison of volatile substances’ types in fermented blank beans samples

由表3和表4可知，6个豆豉样品中检测出了8类挥发性物质，分别为芳香烃类、醇类、酚类、呋喃、吡嗪、酮类、酸类和烷烯烃类，共23种风味物质。共同含有的物质有：苯甲醛、2,3-丁二醇、2,3,5-三甲基吡嗪、乙酸4种物质。检测出的成分中没有酯类，可能是因为干燥时间过长，并且没有在真空干燥箱中进行，使酯类物质挥发。2号样中的挥发性物质种类最多，共有16种，与1号样相比，虽然吡嗪类种类较少，但醇类丰富，醇类的相对含量高达35%，所以异常威克汉姆酵母在醇类风味物质的形成过程中贡献最大。3，4，5，6号样中检测出的挥发性风味物质的种类都少于1号样，但是这4个样中都含有2,3-丁二酮和乙偶姻，1，2号样中均不含这两种酮。所以乳酸片球菌、产酸芽孢杆菌和多种功能菌共同作用在豆豉酮类风味物质的形成过程中都有一定的贡献作用。但综合分析产酸芽孢杆菌和不同功能菌的组合对豆豉总酸、氨基酸态氮、有机酸和挥发性风味物质的形成没有促进作用。

3 结论

本试验采用传统的米曲霉型豆豉发酵工艺在制曲阶段分别加入了不同种功能菌，进行混菌发酵，并对其总酸、氨基酸态氮、挥发性物质及有机酸等风味物质进行测定。结果显示：异常威克汉姆酵母对豆豉中氨基酸态氮的形成有较大的促进作用，含量为1.900 g/100 g。并且在有机酸、醇类风味物质的形成过程中贡献最大，形成了异戊醇、5-甲基-3-庚醇、5-甲基-2-环己醇、2,3-丁烯-2-醇等独特风味物质，醇类的相对含量高达35%。乳酸片球菌对豆豉中总酸的形成有较大的促进作用，含量为1.971 g/100 g，在酮类和有机酸风味物质的形成过程中贡献最大，生成2,3-丁二酮和乙偶姻独特风味物质，使柠檬酸增加了约8.6倍，琥珀酸增加了约23.5倍。产酸芽孢杆菌、异常威克汉姆酵母与乳酸片球菌混合以及3种功能菌混合作用对豆豉中总酸、氨基酸态氮和风味物质的贡献都不明显。此研究对于传统曲霉发酵中接种功能菌对豆豉风味的影响奠定了基础，对在工业上提升豆豉发酵工艺有重要意义。