青方腐乳中丁酸梭菌分离鉴定及与乳酸菌共培养研究

马艳莉，段哲，梁静静，李素萍，丁玉峰，刘亚琼*

(1.南阳理工学院河南省工业微生物资源与发酵技术重点实验室，河南 南阳 473004； 2.河北农业大学 食品科技学院，河北 保定 071000)

益生菌是通过改善宿主微生态环境，提高宿主健康水平的一类有益微生物。丁酸梭菌是近年来备受关注的有利于人体健康的微生物，研究表明，丁酸梭菌可以改善肠道菌群，提高人体免疫力，预防恶性肿瘤发生[1-3]，但其主要代谢产物丁酸通常呈现臭味，容易破坏食品风味，导致丁酸梭菌不能广泛应用于食品生产，然而，丁酸是青方腐乳的关键风味物质，对青方腐乳风味有积极贡献作用[4]，因此青方腐乳可作为丁酸梭菌的良好载体。乳酸菌是目前食品中广泛应用的益生菌[5,6]，研究表明，在腐乳后发酵过程中，乳酸菌对促进产品风味起重要作用[7]。

腐乳作为传统调味品，历史悠久、营养丰富、滋味鲜美，但其含盐量较高，且存在一些其他食用安全隐患[8]，限制了产品消费，阻碍了其工业化、国际化进程。腐乳生产使用较多食盐的主要目的是抑制有害菌生长、控制酶活[9]，而丁酸梭菌和乳酸菌可以抑制有害菌生长，所以可考虑一定程度上代替食盐用于生产腐乳。

益生菌共培养具有重要研究和应用价值，可以产生很多纯培养所不能达到的效果，已有文献报道，益生菌共培养可明显提升菌株的生理代谢能力和生物量，并产生高于纯菌培养的抑菌能力等[10]。已有大量研究报道丁酸梭菌能够促进肠道有益菌增殖、抑制致病菌生长[11,12]，但丁酸梭菌与乳酸菌共培养报道较少。

本研究在前期实验发现青方腐乳富含丁酸及丁酸梭菌基础上，使用亨盖特厌氧法从青方腐乳中分离丁酸梭菌，进行分子生物学鉴定，并研究其与乳酸菌共培养特性，以期为益生菌在青方腐乳中的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验所用乳酸菌为实验室从腐乳中分离保存，命名为LB01；丁酸、乳酸标准品：色谱纯，购自Sigma公司；乙腈：色谱纯，购自Dima公司；乳酸菌琼脂培养基、MRS琼脂培养基、PCA培养基、MRS肉汤培养基、PDA培养基：购自北京奥博星生物技术有限公司；酵母粉、蛋白胨、琼脂粉：购自OXOID公司；菌株测序工作送至北京市理化分析测试中心检测。

1.2 仪器与设备

UV mini 1240紫外-分光光度计、LC-10A高效液相色谱仪 日本Shimadzu公司；HPS-250生化培养箱 哈尔滨市东明医疗仪器厂；超净工作台 北京冠鹏净化设备有限责任公司；F-23 pH 计(精度0.001 g) 日本Horiba公司；YXQ-SG46-280A蒸汽灭菌器 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；AR 2140电子天平 美国Ohaus公司；HZQ-F160振荡培养箱 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；KQ-100E超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；TDL-40B台式离心机 上海安亭科学仪器厂。

1.3 实验方法

1.3.1 丁酸产生菌的分离鉴定方法

1.3.1.1 丁酸梭菌增殖培养基(RCM培养基)的配制方法

胰蛋白胨5 g、0.5% 美蓝0.1 mL、三水合乙酸钠1.5 g、酵母浸膏1.5 g、氯化钠2.5 g、牛肉浸膏5 g、半胱氨酸盐0.25 g、琼脂0.75 g(固体培养基添加)、葡萄糖2.5 g、蒸馏水500 mL，调节pH 值为7.0，灭菌20 min后备用。

1.3.1.2 丁酸梭菌选择性培养基(TSN培养基)的配制方法

琼脂0.25 g(固体培养基添加)、酵母浸膏5 g、多粘菌素0.025 g、胰蛋白胨7.5 g、亚硫酸钠0.5 g、新生霉素0.01 g、枸橼酸铁0.25 g、蒸馏水500 mL，调节pH值为7.0，灭菌20 min后备用。

1.3.1.3 丁酸产生菌的分离培养方法

取新鲜的青方腐乳样品5.0 g，加45 mL无菌水充分混匀，取混合液0.5 mL接种入装有4.5 mL丁酸梭菌增殖培养基的滚管中，在37 ℃条件下富集培养，隔24 h进行一次传代，连续传代4～5次。将发酵液进行梯度稀释，丁酸梭菌选择性培养基在滚管中融化，接种，快速混匀，放置冰槽中，连续滚动至培养基凝固，放置于培养箱中，在37 ℃静置培养，待菌落形成后，将单个菌落转移至液体培养基中进行扩大培养，该操作重复3～4 次，纯化每个单菌落。

1.3.1.4 丁酸产生菌筛选

为筛选丁酸产生菌株，采用HPLC 法对单菌株24 h发酵液中丁酸的含量进行检测。丁酸的检测方法参照Zhang等[13]的方法，略有改动。量取菌株发酵液40 mL，超声振荡30 min，8000 r/min离心20 min，取上清液，过0.45 μm滤膜制得样品提取液。在色谱柱：Shimadzu SCR-101H(10.0mm×7.9 mm×300 mm)；流动相：5 mmol/L的硫酸水溶液；柱温：40 ℃；流速：1.0 mL/min；检测波长：210 nm的色谱条件下进样检测，与丁酸标准品上样制得的标准曲线比对计算得丁酸含量。

1.3.1.5 丁酸产生菌鉴定

为对丁酸产生菌进行鉴定，测定筛选菌株16S rDNA，并结合显微观察、菌落形态、生理生化指标进行。

1.3.2 乳酸菌发酵剂的制备

将乳酸菌LB01以2%的接种量接种于MRS 肉汤培养基中，在37 ℃培养箱中活化24 h，传代3次后对活化好的菌种进行驯化。驯化过程不断加大MRS肉汤培养基中豆浆的比例，从0% 以10%的梯度逐步增加到100%，每次均在37 ℃培养箱中驯化24 h，将驯化好的菌种以2%接种于100 mL灭菌豆浆中，在37 ℃培养12 h后于4 ℃冷藏。

1.3.3 菌悬液制备

将乳酸菌L丁酸梭菌BP01分别接种在MRS固体培养基和梭菌增殖固体培养基上，于恒温恒湿培养箱中37 ℃培养48 h，加入适量生理盐水，充分摇动，分别得到菌悬液，镜检计数，调整其浓度为1×107CFU/mL。

1.3.4 乳酸和丁酸含量测定

使用HPLC法，量取菌株发酵液40 mL，超声振荡30 min，8000 r/min离心20 min，取上清液，过0.45 μm滤膜制得样品提取液。色谱柱：Shimadzu SCR-101H(10.0 mm×7.9 mm×300 mm)；流动相：5 mmol/L的硫酸水溶液；柱温：40 ℃；流速：1.0 mL/min；检测波长：210 nm的色谱条件下进样检测，与乳酸、丁酸标准品上样制得的标准曲线比对计算得乳酸、丁酸含量。

1.3.5 微生物菌落计数

称取新鲜样品5 g，加入45 mL灭菌的生理盐水，涡旋振荡10 min后，安静放置20 min，取1 mL放入9 mL生理盐水中，进行依次10倍的梯度稀释，在适宜的稀释度下进行菌落的计数。细菌在37 ℃条件下，在平板计数琼脂上培养48 h后计数。芽孢菌数使用营养琼脂于37 ℃培养48 h后计数。乳酸菌使用MRS培养基于37 ℃培养48 h计数。丁酸梭菌使用RCM琼脂培养基于37 ℃厌氧培养48 h后计数，结果以log CFU/g 样品表示。

1.4 数据处理与分析

方差分析使用SPSS 23.0 软件开展，使用邓肯氏多重域检验分析数据间的差异性，显著水平选择 p<0.05。每个样品进行2次重复，取平均值。

2 结果与分析

2.1 青方腐乳中丁酸梭菌的分离鉴定

丁酸梭菌是促进肠道微生态健康的一类重要益生菌，前期研究初步确定了青方腐乳中含有丁酸梭菌，为了利用青方腐乳中的丁酸梭菌，发挥其在微生态方面的健康促进作用，本研究采用亨盖特厌氧方法对青方腐乳中的丁酸梭菌进行分离培养(见图1)，共选取单菌落12 株，分别测定培养液中的丁酸含量，从而初步筛选丁酸产生菌株。

图1 亨盖特厌氧法分离培养丁酸梭菌Fig.1 Isolation and culture of Clostridium butyricum by Hungate anaerobic method

菌株代谢产物中丁酸含量测定采用HPLC法进行，测定结果见图2。

图2 分离菌株代谢产物中丁酸含量的HPLC测定结果Fig.2 The butyric acid content of metabolites in isolated strains determined by HPLC method

由图2可知，在筛选出的12株菌中存在2株高产丁酸，分别命名为丁酸产生菌株01(BP01)和丁酸产生菌株02(BP02)，后续实验以此2株菌为实验对象。BP01和BP02菌株培养液中(发酵48 h)的丁酸含量分别达到6.48，3.27 mmol/L。选择BP01菌株进一步进行分子生物学的鉴定，提取该菌株的基因组DNA，以其DNA为模板进行16S rDNA扩增，对目的条带回收后进行克隆测序，结果表明，BP01菌株的16S rDNA基因序列长度为1449 bp，将该序列在GeneBank中进行相似性的比对。

将BP01菌株的16S rDNA序列提交NCBI，使用Blast 程序进行比对分析，共发现16 个同源性最高的菌种(见表1)，对其分析发现这16个菌株均为丁酸梭菌，因此，可以从分子生物学角度判定BP01菌株为丁酸梭菌。

对BP02 菌株16S rDNA 的RCR 扩增产物进行测序，其16S rDNA基因序列长度为1377 bp，进一步在NCBI上进行相似性比对，初步确定其为双酶梭菌(Clostridiumbifermentans)，在NCBI 上的登录号为：JX267051.1，鉴于BP01菌株丁酸产生量较大，并且其作为益生菌认可度较高，因此，后续实验以BP01菌株作为研究对象。

表1 NCBI上与BP01菌株同源性较高的菌株Table 1 The strains with high homology with BP01 in NCBI

续 表

2.2 丁酸梭菌与乳酸菌共培养对乳酸菌的影响

共培养又称混菌培养或混合培养，也称混合发酵，由于不同微生物群体之间可能存在互利共生的关系，因此，当将几种微生物共培养时，可能产生优于单菌培养的效果。有学者的研究显示，菌株混合培养在提高菌株生理代谢功效及生物量方面效果明显，可产生比纯培养更好的效果[14,15]。乳酸菌和丁酸梭菌作为人和动物肠道的益生菌有互利共生的潜在可能性，因此，本研究对从腐乳中分离的乳酸菌LB01和丁酸梭菌BP01进行共培养研究。结果表明，乳酸菌LB01单独培养时，发酵液pH 值迅速降低(见图3)，将丁酸梭菌BP01与其共培养，发酵液pH值降低速度减缓，在培养24 h 时，两种发酵液pH值差异显著(p<0.05)，进一步对乳酸菌LB01单独培养和与丁酸梭菌BP01共培养过程中乳酸浓度进行测定，结果见图4。乳酸菌LB01单独培养时，发酵液乳酸含量迅速增加，在发酵24 h时达到34.6 mmol/L，而与丁酸梭菌BP01共培养时，乳酸浓度增加相对缓慢，且与乳酸菌LB01单独培养时差异显著。这可能是由于共培养时，丁酸梭菌BP01消耗了部分乳酸，延缓了发酵液中乳酸含量的增加和pH值的降低。这与前期实验中发现丁酸梭菌BP01可以利用乳酸支持生长相一致，也和乳酸菌与丁酸梭菌的益生特性相符。人和动物肠道中存在大量乳酸菌，代谢产生乳酸，而健康人的粪便中几乎检测不到乳酸，这和肠道中存在的丁酸梭菌等益生菌利用乳酸调节肠道pH 值，防止因乳酸积累引起酸中毒相关。

图3 发酵液pH值变化曲线Fig.3 Changes in pH values of fermentation broth

图4 发酵液乳酸浓度变化曲线Fig.4 Changes in lactic acid concentration of fermentation broth

使用MRS 培养基对发酵24 h 的发酵液中乳酸菌进行计数，结果见图5。乳酸菌LB01单独培养24 h 时，发酵液中菌株数量达7.5×107CFU/mL，与丁酸梭菌BP01共培养时，乳酸菌LB01的生长没有受到抑制，相反，丁酸梭菌BP01 有促进乳酸菌LB01生长的现象，共培养24 h后，乳酸菌LB01数量达9.8×107CFU/mL，这表明丁酸梭菌BP01能很好地促进乳酸菌LB01生长，可使其发酵24 h的活菌数提高30.7%。

发酵24 h后，丁酸梭菌BP01与乳酸菌LB01共培养的活菌数要明显高于丁酸梭菌BP01单独培养的活菌数，分别为10.8×106CFU/mL和6.5×106CFU/mL，表明乳酸菌LB01对丁酸梭菌BP01具有很好的促生长作用。进一步对培养24 h的发酵液中丁酸含量进行测定，见图7。

图5 培养24 h的发酵液中乳酸菌数量Fig.5 The number of lactic acid bacteria in fermentation broth cultured for 24 h

2.3 丁酸梭菌与乳酸菌共培养对丁酸梭菌的影响

对培养24 h的发酵液中丁酸梭菌数量进行测定，结果见图6。

图6 培养24 h的发酵液中丁酸梭菌数量Fig.6 The number of Clostridium butyricum in fermentation broth cultured for 24 h

图7 培养24 h的发酵液中丁酸含量Fig.7 The butyric acid content in fermentation broth cultured for 24 h

由图7可知，丁酸梭菌BP01单独培养24 h，发酵液中丁酸含量可达6.5 mmol/L，与乳酸菌LB01共培养时，发酵液中丁酸含量明显上升，培养24 h 时达到10.2 mmol/L，而乳酸菌LB01单独培养时，发酵液中未检测到丁酸，进一步验证了乳酸菌LB01和丁酸梭菌BP01有很好的互利共生关系，可以在后续实验中进行共同培养发酵。目前已有学者使用复合益生菌开发新产品，提升产品品质，例如，胡强等[16]将分别来自于动物和植物的益生菌共培养开发了新型复合益生菌调味笋，提升了产品的益生功效。

3 结论

本研究在前期实验基础上从青方腐乳中分离出丁酸产生菌，分子生物学鉴定为丁酸梭菌，丁酸梭菌BP01与乳酸菌LB01共培养实验发现，二者具有互利共生关系，丁酸梭菌BP01 可以促进乳酸菌LB01生长，使其发酵24 h的活菌数提高30.7%，可防止乳酸过度积累，乳酸菌LB01也可促进丁酸梭菌BP01生长，共培养24 h发酵液中丁酸含量明显上升，由单独培养6.5 mmol/L增加为10.2 mmol/L，研究结果可为益生菌在青方腐乳中的应用奠定基础。