迷迭香酸联合槲皮素对人肝癌HepG2细胞增殖和迁移的影响

刘庆东，白跳艳，王晔飞，姚杨

作者单位：1榆林市第一医院，a消化内科，b肝胆外科，陕西 榆林719000；2西安医学院第一附属医院，a检验科，b中心实验室，陕西 西安710077

原发性肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，发病率和病死率较高［1-3］。尽管肝癌的治疗方法不断进步，但仍然存在预后效果差、术后转移或复发率高、对放化疗不敏感等局限性［4-6］。因此迫切需要寻找安全有效的治疗策略。槲皮素（quercetin）是一种天然的黄酮类化合物，能够抑制多种肿瘤细胞的增殖、转移的作用［7-8］。迷迭香酸（rosmarinic acid）是一种广泛分布的水溶性酚酸类化合物［9-10］。且具有抗炎、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤等多种药理作用［11-13］。其抗肿瘤作用受到广泛关注。但目前尚无文献报道槲皮素联合迷迭香酸对HepG2细胞的影响。本研究2018年1月至2019年1月选用人肝癌HepG2细胞为模型，观察槲皮素与迷迭香酸联合应用对HepG2细胞增殖及凋亡的影响，并探讨其可能的作用机制，为其应用于肝癌的临床治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1材料试剂：10%小牛血清（四季青生物工程公司），3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT，美国sigma 公司）；槲皮素及迷迭香酸购自美国Signal Chemical公司，RPMI-1640培养基（Gibco公司）槲皮素及迷迭香酸用二甲基亚砜（DMSO）超声溶解，配成不同质量浓度的溶液，然后用0.22 μm微孔滤器过滤，灭菌，4 ℃保存备用。

仪器：二氧化碳培养箱（美国Thermo 公司），96孔板、6孔板（美国Thermo Fisher Scientific 公司），流式细胞仪（FranklinLakes），全自动酶标仪（美国Molecular Devices 公司），实时定量PCR 仪（美国Bio-Rad），离心机（美国Bio-Rad）。

1.2 HepG2细胞培养及分组将HepG2细胞复苏后，37 ℃、5%二氧化碳孵箱内培养培养。其中RPMI-1640 培养基内含3%小牛血清，青霉素100 U/mL、链霉素100 μg/mL。每2～3 天传代换液1 次，取对数生长期的细胞进行实验。将处于对数生长期的HepG2细胞以5×104/mL 接种至96 孔板中培养24 h。分为空白对照组（只加DEME培养液），槲皮素单独处理组（DMEM 培养液+DMSO+12.5、25.0、50.0 和100.0 μmol/L 槲皮素溶液），迷迭香酸单独处理组（DMEM 培养液+DMSO+12.5、25.0、50.0 和 100.0 μmol/L 迷迭香酸溶液）单药及联合用药组（DMEM培养液+DMSO+IC50 槲皮素+IC50 迷迭香酸），各组培养24 h后进行后续实验。

1.3四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT法）检测细胞活力将处于对数生长期的HepG2细胞以5×104/mL接种至96孔板中培养24 h，每孔200 μL倒掉培养液，按照上述分组操作，再培养24 h后弃液，每孔加入MTT 20 μL，继续培养4 h后，吸去上清液，每孔加入DMSO 溶液150 mL，放至摇床低速振荡10 min，使各孔结晶物充分溶解，采用全自动酶标仪在570 nm处测各孔吸光度。

1.4划痕实验将处于对数生长期的HepG2细胞接种到6孔板，调整细胞密度为5×105/mL，摇匀后与37 ℃、5%二氧化碳培养箱中常规培养过夜，用记号笔在6 孔板底部画3 条水平直线，常规培养至90%融合状态。用移液器在细胞板上划痕，磷酸缓冲盐溶液（PBS）冲洗以去除悬浮细胞，同时在各药物组中分别加入用1.5%血清培养基配置的不同浓度迷迭香酸及槲皮素，镜下记录划痕宽度并拍照。37 ℃、5%二氧化碳体积分数为5%的培养箱中继续培养36 h，倒置显微镜下观察划痕愈合程度并拍照。计算各组划痕距离。

1.5蛋白质印迹法检测蛋白表达收集上述各组细胞，BCA 法测定蛋白浓度，取50 μg 等量蛋白上样，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜，封闭液室温封1h，加入一抗N-钙黏蛋白（N-cad）（1∶300），E-钙黏蛋白（E-cad）（1∶500），甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）（1∶500）。4℃孵育过夜，加入辣根过氧化酶标记的二抗（1∶1 000），室温孵育2 h，凝胶成像分析系统扫描分析。以GAPDH 为内参计算各组目的蛋白的表达水平。

1.6统计学方法计量资料xˉ±s表示，多组定量数据的比较采用单因素方差分析的方法，多组之间两两比较采用LSD-t检验，所有数据采用SSPS 17.0 统计软件分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1细胞增殖结果12.5、25.0、50.0和100.0 μmol/L槲皮素对HepG2细胞抑制率分别为（16.9±3.2）%，（28.9±3.4）%，（39.6±4.2）%，（53.5±2.3）%，12.5，25，50，100 μmol/L 迷迭香酸对HepG2细胞抑制率分别为（5.2±1.2）%，（12.3±1.6）%，（39.8±2.1）%，（62.5±3.4）%；以上结果表明不同浓度槲皮素及迷迭香酸单独作用于HepG2细胞均表现出浓度依赖性的细胞活力抑制效果，但是抑制率仍然不高。二者联合处理人 HepG2细胞 24 h 后，12.5、25.0、50.0 和 100.0 μmol/L 对HepG2细胞抑制率分别为（25.1±3.5）%，（52.3±4.2）%，（62.5±5.1）%，（78.2±3.6）%，可显著抑制细胞活力（F＝4.25，P＝0.02）。

2.2划痕实验结果25 μmol/L 迷迭香酸组及25 μmol/L槲皮素组均能抑制细胞的迁移，划痕愈合距离分别为（11.35±2.37）mm、（11.46±3.86）mm。迷迭香酸及槲皮素联合组划痕愈合距离为（4.36±0.56）mm，细胞间划痕距离缩小趋势较迷迭香酸及槲皮素单独使用有所减缓（F＝6.73，P＝0.003）。该结果提示槲皮素及迷迭香酸联合组能显著抑制细胞迁移。

2.3相关分子含量检测蛋白质印迹法检测结果表明：与对照组相比，槲皮素组及迷迭香酸组中N-cad蛋白表达水平下降，其蛋白相对表达量为（0.98±0.05）及（0.73±0.02）。E-cad 蛋白表达增加，其蛋白相对表达量为（1.02±0.10）及（1.25±0.14），而槲皮素+迷迭香酸组N-cad（0.61±0.07）及 E-cad（1.42±0.06）蛋白表达变化更加明显（N-cad：F＝3.28，P＝0.03；E-cad：F＝5.28，P＝0.02）。见图1。

图1 蛋白质印迹法检测各组E-钙黏蛋白（E-cad）和N-钙黏蛋白（N-cad）基因表达

3 讨论

肝癌病死率高，预后效果不理想，治疗难度大，因此迫切需要寻找一种有效治疗肝癌的临床药物［14］。槲皮素是一种天然黄酮类化合物，具有抗氧化、抗菌消炎、抗病毒、防癌、抗癌等作用［15-16］。迷迭香酸是一种天然的苯酚羧酸，以唇形科和紫草科含量最高。迷迭香酸具有抗癌、抗过敏、抗氧化、抗炎等作用［17］。

上皮-间质转化（EMT）是恶性肿瘤浸润与转移的重要因素，其过程涉及许多EMT 相关蛋白的参与。其中E-cad 和N-cad 被认为是最显著的标志蛋白。E-cad 表达于细胞膜表面，是一个与钙离子有高度结合亲和力的一种细胞黏附糖蛋白，对维持细胞间的通讯与黏附有重要作用，在多种恶性肿瘤的迁移侵袭阶段占重要地位。张杰东等［18］研究发现E-cad 在甲状腺乳头状癌中低表达，与甲状腺乳头癌的发生、发展及转移中起重要作用，可作为临床诊断和预后的指标。罗婷婷等［19］研究发现E-cad能有效抑制鼻咽癌CNE-2细胞的体外迁移和侵袭。N-cad 可以克服E-cad 介导的细胞间牢固的黏附而影响上皮细胞的形态和行为，促进肿瘤细胞浸润。但关于两种蛋白在肝癌防治机制中的研究却较少。

本研究以人肝癌HepG2细胞为模型，考察迷迭香酸与槲皮素联用对N-cad 及E-cad 表达的影响，结果显示，两药联合能明显抑制肝癌HepG2 细胞的活力，抑制细胞迁移，并呈现浓度依赖关系，并通过蛋白质印迹法检测发现两药联合使用较单独应用迷迭香酸可显著上调E-cad 和下调N-cad 蛋白的表达。这说明槲皮素增强迷迭香酸对肝癌HepG2细胞增殖的抑制作用的机制可能是通过调控E-cad、N-cad蛋白的表达，其机制可能与EMT有关。为肝癌的临床治疗提供了有力的实验证据。