麻杏石甘汤对重症肺炎大鼠肺组织炎症的影响及其机制

文杨，张军，王毅

作者单位：重庆市高新区人民医院，a急诊重症医学科，b呼吸科，重庆400039

肺炎是一种常见的疾病，在一部分病人中变得严重，这取决于宿主的免疫抵抗［1］。2016 年的死亡率趋势分析显示，美国肺炎继续造成的死亡人数超过任何其他传染病，在之前的34年期间没有任何改善［2］。即使不是致命的，肺炎也可能是严重的；1/5的肺炎住院病人需要进入重症监护病房，其中1/3需要机械通气［3］。重症肺炎病程急，易引起多器官衰竭，病死率高。在临床上中药治疗重症肺炎取得良好的效果，如清燥救肺汤、清金化痰汤、通腑清热化痰中药等［4-6］。大量研究报道，麻杏石甘汤（MGD）在重症肺炎的治疗中具有良好的治疗效果，但是，其机制尚未清晰。本研究于2018年5月至2019年1月通过肺炎克雷伯菌建立重症肺炎大鼠模型，检测MGD对大鼠血清中炎性因子肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素1β（IL-1β）含量的影响，揭示MGD的抗炎功能与抑制NF-κB信号通路相关，为MGD治疗重症肺炎提供参考。

1 材料与方法

1.1材料实验动物无特定病原体（SPF）级大鼠（230～250 g）80 只，购于湖南斯莱克实验生物有限公司，生产许可证号：SCXK（湘）2013-0004，遵守实验动物管理和伦理委员会章程对动物进行饲养和相关实验；肺炎克雷伯菌标准株购于ATCC；加味MGD 颗粒（麻黄4 g、苦杏仁10 g、生石膏20 g、甘草4 g、防风10 g、前胡10 g、黄芩10 g）由北京康仁堂药业公司赠送；兔抗鼠核因子κB 抑制蛋白（IκBα）多克隆抗体、兔抗鼠p65 多克隆抗体、兔抗鼠磷酸化IκBα（p-IκBα）多克隆抗体购于美国Cayman Chemical；羊抗鼠辣根过氧化物酶标记的免疫球蛋白G（IgG）抗体购于上海烜雅生物科技有限公司；大鼠TNF-α 检测试剂盒、大鼠 IL-6 检测试剂盒、大鼠 IL-1β 检测试剂盒均购于碧云天；聚偏二氟乙烯膜（PVDF 膜）购于德国罗氏诊断有限公司；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）试剂盒、ECL 发光液和RIPA 蛋白裂解液均购于大连Takara公司。

1.2方法

1.2.1 重症肺炎大鼠模型的制造 将大鼠手术前24 h禁食，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉。将大鼠固定后，切开颈部皮肤，暴露上段气管，再用1 mL注射器穿刺滴入0.30 mL 的肺炎克雷伯菌液，迅速树立固定大鼠，使菌液均匀于肺部，最后，缝合伤口并消毒。接种后正常培养大鼠，至第6 天成功建立重症大鼠肺炎模型，标记为模型组。

1.2.2 分组与处理 MGD 制备：按照《医疗机构中药煎药室管理规范》煎制麻黄、杏仁、甘草、石膏。先将麻黄、杏仁、甘草、石膏用双蒸水浸泡1 h，然后将石膏煮20 min 后将浸泡的药材一起煎煮20 min。取第一道汁加入2 倍双蒸水煎煮15 min 后，取出汁液，混入第一道汁，将汁浓缩至原来的体积，调整浓度至23.65 g/kg。置于4 ℃冰箱中保存备用。

分组：按照随机数字表法将正常饲养的80只大鼠分成对照组、模型组、模型+0.9%氯化钠溶液组、模型+MGD 组，每组20 只。对照组：正常饲养的20只大鼠；模型组：照1.2.1的方法将剩余60只大鼠进行重症肺炎模型制造；模型+0.9%氯化钠溶液组：将20 只模型组大鼠进行等量的0.9%氯化钠溶液灌胃；模型+MGD 组：将 20 只模型组大鼠进行 MGD 灌胃。饲养15 d后进行大鼠眼眶静脉采血，之后进行断颈法处死大鼠，再无菌小心剥离完整的左肺部和右肺部，将血液和肺置于-20 ℃保存。

1.2.3 血气指标的分析 建模结束后，对大鼠进行腹主动脉采取2 mL血液，对血气指标动脉血氧分压（PaO2）、动脉血二氧化碳分压（PaCO2）和血氧饱和度（SaO2）进行分析检测。

1.2.4 肺湿干比重的检测 用电子天平称量湿肺的重量，然后置于80 ℃烘箱中烘干20 h，再次称量肺的重量，计算湿重/干重的比。

1.2.5 苏木精-伊红（HE）染色观察肺组织病理变化 取适量肺组织在多聚甲醛溶液中固定30 min，置于脱水机中脱水，经透明浸蜡过夜后，进行石蜡包埋。将石蜡块切片（厚4 μm），烤片机烘烤15 min，脱蜡、苏木精染色10 min后，放入盐酸乙醇中3 s，再置于氨水中5 s，最后放入伊红中染色2 min，经二甲苯透明、中性树脂封片后，显微镜观察。

1.2.6 酶联免疫吸附试验（ELISA）检测大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β 的含量 按TNF-α 检测试剂盒、IL-6检测试剂盒、IL-1β检测试剂盒说明书要求检测大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β的含量。

1.2.7 蛋白质印迹法检测肺组织中IκBα、p65、p-IκBα的蛋白表达 将大鼠的右肺用无菌剪碎，再在研钵中充分研磨，用RIPA 蛋白裂解液对研磨组织进行冰上蛋白裂解30 min，提取总蛋白，以BCA法测定样品蛋白的浓度。以4∶1的比例加入蛋白上样缓冲液（×5），混匀，沸水浴变性5 min，离心取上清，取60 μg 目的蛋白进行SDS-PAGE 蛋白电泳。Quantity One 4.62图像分析软件进行条带灰度分析，Image J分析目的条带的灰度值，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参，以目的条带灰度值与GAPDH灰度值的比值表示目的蛋白的表达。

1.3统计学方法采用SPSS 21.0 软件进行分析。计量资料用xˉ±s表示，多组间数据比较采用单因素方差分析，多组间的两两比较采用SNK-q检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MGD对肺炎大鼠肺组织病理组织观察及血气指标的影响结果如图1、表1所示，与对照组相比，模型组肺组织毛细血管扩张、充血出血、淋巴细胞、单核细胞呈围管状浸润，PaO2显著降低，PaCO2显著升高，SaO2显著降低（P＜0.01）；与模型+0.9%氯化钠溶液组相比，模型+MGD 组肺组织有少量或无炎症细胞，PaO2显著升高，PaCO2显著降低，SaO2显著升高（P＜0.001）。

表1 麻杏石甘汤（MGD）对重症肺炎大鼠血气指标的影响/xˉ±s

2.2 MGD对肺炎大鼠肺组织湿干比重的影响四组湿干比整体比较，差异有统计学意义（F＝14.686，P＜0.001）。与对照组相比，模型组湿干比显著升高［（5.31±0.51）%比（3.98±0.33）%，P＜0.05］；与模型+0.9%氯化钠溶液组相比，模型+MGD 组湿干比显著降低［（4.29±0.40）%比（5.28±0.48）%，P＜0.05］。

2.3 MGD对肺炎大鼠血清中炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β的影响结果如表2所示，与对照组相比，模型组大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β 的含量均显著升高（P＜0.001）；与模型+0.9%氯化钠溶液组相比，模型+MGD组大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β的含量显著降低（P＜0.001）。

表2 麻杏石甘汤（MGD）对重症肺炎大鼠血清中炎性因子肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素1β（IL-1β）的影响/xˉ± s

2.4 MGD对肺炎大鼠肺组织中NF-κB信号通路活性的影响结果如图2、表3所示，与对照组相比，模型组大鼠肺组织中IκBα的蛋白表达量显著降低，p65、p-IκBα 的蛋白表达量均显著升高；与模型+0.9%氯化钠溶液组相比，模型+MGD 组大鼠肺组织中IκBα的蛋白表达量显著升高，p65、p-IκBα的蛋白表达量均显著降低（P＜0.05）。

图2 麻杏石甘汤（MGD）对重症肺炎大鼠肺组织中核因子-κB（NF-κB）信号通路表达的影响（蛋白质印迹法）

表3 麻杏石甘汤（MGD）对重症肺炎大鼠肺组织中核因子-κB（NF-κB）信号通路活性的影响/xˉ± s

3 讨论

MGD是由麻黄、杏仁、石膏、甘草组成，源于《伤寒杂病论》，具有清肺平喘的功效［7］。程永华等［8］在重症肺炎的病人中发现，MGD辅助西药对重症肺炎病人具有抑制炎性分泌、改善呼吸功能，缓解病情的功能，在临床上具有较好的治疗作用。张怡等［9］报道，加味MGD可抑制重症肺炎病人血清中炎性因子的表达，并下调前白蛋白和高迁移率族蛋白B1的表达。姜丽等［10］报道，MGD的主要药理成分在RSV肺炎大鼠中的吸收明显优于正常大鼠的吸收。本研究建立了肺炎克雷伯菌诱导的重症肺炎大鼠模型发现，MGD可抑制重症肺炎大鼠血液中炎性因子的含量。

NF-κB是炎症和免疫反应的重要中介［11-13］，可通过诱导巨噬细胞表型的重要炎症介质，如TNF、IL-6、白细胞介素8（IL-8）、IL-1β、白细胞介素12（IL-12）和细胞色素C 氧化酶-Ⅱ（COX-Ⅱ）［14-16］。中药安肠愈疡汤可治疗溃疡性结肠炎大鼠结肠组织中炎性因子的含量，其功能与抑制NF-κB 的表达相关［17］；犀角地黄汤加味可通过抑制NF-κB 信号通路的激活减轻败血症导致的小鼠肺部炎症和损伤［18］；补肺汤可剂量依赖性调节Toll样受体2（TLR2）/NF-κB信号通路改善慢性阻塞性肺疾病大鼠气道重塑［19］；藤莓汤可通过调节肿瘤坏死因子受体作用因子3（TRAF3）/NF-κB 信号通路改善胶原诱导性关节炎模型大鼠滑膜免疫炎性损伤［20］。本研究运用蛋白质印迹法检测了重症肺炎大鼠肺组织中NF-κB 信号通路相关蛋白IκBα、p65、p-IκBα 的表达发现，该通路在重症肺炎模型大鼠中的表达明显升高，经MGD 治疗后，NF-κB 信号通路的活性明显受到抑制，提示MGD在重症肺炎大鼠中的治疗功能的机制与失活NF-κB 信号通路有关。这些结果为探索MGD 的功能机制的研究提供了参考，也为MGD 治疗重症肺炎提供了更充分的理论依据。

（本文图1见插图9-3）

图1 重症肺炎大鼠肺组织病理图片（HE染色×200）：A为对照组，B为模型组，C为模型+0.9%氯化钠溶液组，D为模型+麻杏石甘汤（MGD）组