反相高效液相色谱法测定人血清中拉莫三嗪的浓度

王晓娟，袁君，黄庆，赵伍西

作者单位：1淮南市第一人民医院药学部，安徽 淮南232007；2淮南联合大学医学系，安徽 淮南232007

拉莫三嗪（lamotrigine）是一种电压门控式钠离子通道阻滞剂，为广谱抗癫癎药，广泛用于控制各种类型的癫癎发作，被抗癫癎药物应用专家共识［1］癫癎（2011 年）列为健康育龄期妇女特发性全面性癫癎及症状性部分性癫癎的首选用药。但由于拉莫三嗪受遗传因素、联合用药等因素影响，有效血药浓度个体差异大，与剂量相关性差，治疗窗窄，因此临床应用需进行拉莫三嗪的血药浓度监测［2-6］。本研究于 2013 年 5 月至 2016 年 5 月查阅相关文献［7-9］建立了人体血清拉莫三嗪浓度的反相高效液相色谱方法，测定时间缩短，线性范围扩大，准确性提高，适用于拉莫三嗪血药浓度的临床常规监测，为拉莫三嗪的个体化治疗提供科学依据。

1 仪器与试剂

1.1仪器Agilent1260 高效液相色谱仪，DADG1316A 检测器；FA1104 电子天平（上海良平仪器厂）；XW-80A 涡旋振荡器（上海医科大学仪器厂）；H-1850R 型号离心机（湖南湘仪仪器厂）；高纯度氮气和氮吹仪（BYDCY-24S）；DK-420数显恒温水浴锅（上海三发科学仪器有限公司），D1810C自动双重纯水蒸馏器（上海申胜生物技术有限公司）。

1.2试剂拉莫三嗪对照品、艾司唑仑对照品（中国药品生物制品检定所，批号10075-20041、1219-0102）；乙腈含量≥99.9%（色谱纯，批号S92150，sigma 公司）；正戊烷含量≥98.5%（色谱纯，上海凌峰化学试剂有限公司，批号20150310）；甲醇含量≥99.8%、乙酸乙酯含量≥99.5%、氯仿含量≥99.5%（均为色谱纯，国药集团化学试剂有限公司，批号分别为20141022、20151202、20150921）；磷酸二氢钠含量≥99.5%（天津市光复科技有限公司，批号20140731）；自制重蒸馏水；正常人空白混合血清（淮南市第一人民医院检验科提供）。

1.3溶液的配制拉莫三嗪储备液配制：精密称取拉莫三嗪对照品25 mg，加入甲醇溶解，定容到100 mL容量瓶中，得250 mg/L拉莫三嗪储备液。艾司唑仑内标液配制：精密称取艾司唑仑对照品38.6 mg，加甲醇溶解，定容到50 mL 容量瓶中，得浓度为772 mg/L的艾司唑仑内标液。上述溶液放置在4 ℃冰箱保存备用。

2 方法与结果

2.1色谱条件色谱柱规格Agilent C18（4.6×150 mm，5 μm）（Agilent公司）；流动相配比为甲醇∶磷酸二氢钠缓冲液（56∶44，pH 6.0）；流速1.0 mL/min；检测波长210 nm，液相色谱柱温30 ℃；进样量10 μL。

2.2样品处理精密吸取艾司唑仑内标液10 μL于离心管中氮气吹干，加人混合血清样品100 μL，乙酸乙酯 600 μL 涡旋 2 min，离心 5 min（8 000 r/min）。取出上清液，下层再次加入600 μL 乙酸乙酯，涡旋2 min，离心5 min（8 000 r/min），合并两次上清液。55°C水浴，氮气吹干，残渣用流动相100 μL溶解，混匀30 s，离心5 min（8 000 r/min），于“2.1 色谱条件”下取10 μL进样测定。

2.3方法专属性取空白血清按“2.2”项下方法处理分析，拉莫三嗪和内标峰型良好，两者保留时间分别为3.8 min 和11.5 min，空白血清内源性物质不干扰测定。按照上述方法考察同时加入卡马西平、苯妥英钠及丙戊酸钠对实验的干扰，卡马西平及苯妥英钠保留时间分别为7.4 min和6.5 min，丙戊酸钠无峰，三者均不干扰拉莫三嗪测定。结果见图1。

2.4标准曲线与线性范围拉莫三嗪储备液用甲醇稀释，配成浓度分别为 0.10、0.50、2.50、10.00、25.00、50.00、100.00 mg/L 的拉莫三嗪标准液。按2.2 项下方法处理进样测定。以拉莫三嗪与内标峰面积比值为纵坐标（Y），拉莫三嗪质量浓度为横坐标（X），进行线性回归。得拉莫三嗪回归方程Y＝0.020 1X+0.025 2（r＝0.999 6），在0.10～100.00 mg/L范围内线性关系良好，定量下限为0.10 mg/L。

2.5精密度和回收率取空白血清100 μL，准确加入一定量的拉莫三嗪标准储备液，配制低、中、高质量浓度分别为0.25、2.50 和25.00 mg/L 的拉莫三嗪质控血清，每个浓度各5份，取上述系列浓度的标准质控血清样品，按“2.2”项下方法操作，以当日回归方程计算各药物浓度，以加入质量浓度与实测质量浓度之比计算相对回收率。上述3种浓度的标准质控血清样品在同一天内分别测定3 次和连续3 d 每天测定1 次，测得的血药浓度计算日内精密度和日间精密度，结果见表1。

2.6稳定性取2.5项方法配制的0.25、2.50、25.00 mg/L 浓度的拉莫三嗪质控血清，室温放置24 h，-20 ℃冰冻7 d 和-20 ℃冰冻1个月的稳定性。按“2.2”项下方法操作，分别测定拉莫三在室温放置24 h 和-20 ℃冷冻 7 d、1 个月前后的拉莫三嗪峰面积之比，相对标准偏差（RSD）分别为1.5%、1.2%及0.9%，表明在此条件下，拉莫三嗪稳定性良好。

图1 拉莫三嗪和艾司唑仑的反相高效液相色谱图：A为空白血清图；B为拉莫三嗪血清图；C为拉莫三嗪+艾司唑仑血清图

表1 人血清中拉莫三嗪的精密度和回收率

3 讨论

以艾司唑仑为内标，而非文献报道［10-11］的氯唑沙宗，因可能需要同时监测卡马西平、苯巴比妥、苯妥英钠等药物的血浓度，可以缩短实验时间和节约检测成本，但多种成分同时监测，拉莫三嗪与苯巴比妥分离度较差，还需进一步优化。流动相的组成、比例选择参考相关文献［12-13］，甲醇与水，或乙腈与水影响拉莫三嗪和内标峰型，而采用甲醇∶磷酸二氢钠缓冲液（56∶44，pH 6.0）峰型较为理想。乙酸乙酯作为萃取溶剂，比乙醚、乙酸乙酯、氯仿、正戊烷毒性低，杂质峰少，回收率高而稳定，分离效果好。但乙酸乙酯挥发慢，因此血样处理采用55°C水浴，氮气吹干。

应用本方法监测数百例服用拉莫三嗪病人的血清药物浓度，所有病人的血清浓度均在0.10～100.00 mg/L线性之内，无特殊情况当天可以出监测报告，说明该方法方便、快捷、准确，能够满足拉莫三嗪血清浓度的临床常规监测需要，给临床癫癎病人拉莫三嗪个体化治疗提供科学、准确的用药依据。