基于RNA Seq技术分析江西豆豉对肠上皮细胞基因差异表达的影响

谭强来 曾臻 武晓丽 徐锋

摘 要：目的：基于RNA Seq研究江西传统特色豆豉与肠上皮细胞的相互作用。方法：Caco 2细胞与豆豉水提样共孵育后，采用RNA Seq筛选差异表达基因，进行KEGG、GO和PPI网络分析。结果：筛选差异表达基因17 892个，其中显著性240个，含上调表达125个、下调表达115个。KEGG功能注释215个信号通路，主要富集在新陈代谢、免疫系统、细胞调控、细胞粘附等类别。GO分析主要涉及免疫应答、细胞结构及功能调控、营养素代谢、神经传导及激素分泌调节等生物学过程。PPI网络分析在STRING数据库内有效注释的204个基因编码的蛋白互作，其中IL8、VCL、NFKBIA等节点度较高。结论：江西传统特色豆豉可引起肠上皮细胞多类基因差异表达，为阐明豆豉对肠道健康作用的分子机制提供科学依据。

关键词：豆豉;肠上皮细胞;RNA Seq;基因差异表达

研究表明，豆豉微生物发酵过程中可生成纤溶酶、异黄酮甙元、α 葡萄糖苷酶抑制剂等各种活性成分，从而发挥降血脂、降血糖、维持肠道菌群平衡、调节中枢神经系统、保护早期动脉粥样硬化血管内皮损伤等保健功能[1]。目前研究主要集中在微生物组成或功效组分的活性筛选鉴定[2 4]，采用转录组学技术从分子水平探究豆豉与肠道相互作用机制尚未报道。RNA Seq结合了转录组建库方法与数字基因表达谱信息分析手段，相比传统基因芯片，具有可检测低丰度基因，定量准、重复性好等优点[5]，适用于全面的差异基因表达及功能聚类分析，探寻生物学功能及分子作用机制，近年来渐成转录组学研究的主流工具。徐柳柳等[6]采用RNA Seq筛选禽致病性大肠杆菌感染的雏鸡肠道免疫相关基因。本研究采用RNA Seq分析江西传统特色豆豉作用后肠上皮细胞的基因表达差异，经KEGG富集、GO功能和PPI网络分析，以期从分子水平上识别其功能、参与的代谢通路和相互作用途径，为阐明豆豉对肠道健康作用的分子机制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

豆豉，由南昌稻香园调味食品有限公司提供，参照文献[7]制备豆豉水提物并作适当调整，简述如下：无菌条件下称取磨碎过筛的豆豉，按豆豉（W）：无菌PBS（V）=1∶9充分混匀，于4℃下振荡浸提过夜后，经 1 000 r/min离心10 min及无菌滤膜过滤除去颗粒残渣，收集上清液，冷冻干燥后即得。人结肠癌Caco 2细胞，为本实验室液氮冻存，经复苏后，置含10%胎牛血清的DMEM培养基的25 mm2细胞培养瓶，于5% CO2细胞培养箱37℃培养至融合率80%～90%;如需传代，用0.25%胰酶 EDTA消化、离心、重悬至新瓶。

1.2 方法

1.2.1 实验样品组处理 收集对数生长期Caco 2细胞，调整细胞密度约为1×105个/mL，转移至24孔板培养约24 h至完整单细胞层形成，移除培养上清，以450 μL/孔加入新鲜细胞培养液，再将50 μL已制备好的豆豉样品加入，于5% CO2细胞培养箱37℃共孵育 2 h，设6个复孔，为样品处理组;另设加等量不含豆豉样品的无菌PBS共孵育的Caco 2细胞孔为阴性对照组。

1.2.2 RNA Seq实验 由深圳华大基因科技服务有限公司完成。实验步骤简述如下：用TRNzol法分别提取两组细胞总RNA，加DNaseI消化杂质DNA去除干扰;用带Oligo（dT）的磁珠富集mRNA;加入适量打断试剂，高溫条件下得到片断化的mRNA;再以此模板合成cDNA;经磁珠纯化、末端修复、3’末端加A碱基、加测序接头后PCR扩增，构建文库;经检测质控合格后Illumina HiSeq TM 2000测序。

1.2.3 数据处理与分析 测序原始数据（raw reads）经滤除低质量、重复、接头等序列后得过滤后数据（clean reads），根据基因的表达量（FPKM值）和错误发生率（FDR）多重检验校正P值，分析两组样品间的共有和特异表达基因，并以“FDR≤0.001且倍数差异在2倍以上”为标准界定显著差异表达基因。对样品间差异表达基因进行KEGG富集分析，以确定差异表达基因最主要参与的生化代谢途径和信号转导途径，从而进一步了解其生物学功能;进行GO功能（涵盖分子功能、生物过程、细胞组分等三类）分析，以对差异表达基因的功能进行预测、鉴定和验证;采用STRING 10.5在线数据库（https：//string db.org/）进行蛋白互作网络分析，以对显著差异表达基因（蛋白）间相互作用进行功能关联。

2 结果与分析

2.1 测序质量评估

阴性对照组、豆豉样品处理组RNA转录组测序clean reads分别获得22 250 879、22 216 538条，分别占raw reads的99.55%、99.4%，表明测序质量比较好。

2.2 比对分析

将阴性对照组、豆豉样品处理组的clean reads使用Bowtie软件比对到参考基因，基因覆盖率分别占72.83%、73.82%;利用BWA软件比对到参考基因组，基因组覆盖率分别达86.82%、89.02%;可注释的表达基因分别为16 729、17 127个，表明测序覆盖率较高、整体质量较好。

2.3 差异表达基因筛选

根据基因的表达量（FPKM值）分析两组样品间的共有和特异表达基因（合计17 892个）绘制成散点图（图1）。与阴性对照组相比，除去共有表达基因15 964个，豆豉样品处理组另有特异表达基因共1 928个，其中上调表达765个、下调表达1 163个。在此基础上，基于泊松分布的分析方法，以“FDR≤0.001且倍数差异在2倍以上”为标准，筛选显著差异表达基因，共筛选出显著差异表达基因240个，其中上调表达125个、下调表达115个。

2.4 差异表达基因KEGG富集分析

豆豉样品处理组与阴性对照组相比，其引起Caco 2细胞差异表达基因共得到215个信号通路条目的功能注释。将富集程度排名前20的信号通路条目以图形化方式展示（图2），其中包括细胞间粘附连接相关的ko04520：Adherens junction和与细胞调控相关的ko04012：ErbB signaling pathway，表明豆豉样品处理或显著地影响肠上皮细胞结构和功能完整性。因此，为更全面且有针对性地综合分析其生物学效应，将各信号通路根据所注释的功能归类去冗，主要富集在新陈代谢（65个）、免疫系统（16个）、细胞调控（10个）、神经系统（9个）、细胞粘附（7个）和胰岛素—糖尿病（4个）等类别。

筛选各类部分典型信号通路，对涉及的差异表达基因组成进行分析（表1），其中40个显著差异表达基因以下划线标示。在免疫系统相关信号通路中，大量差异表达基因富集在“ko04060：Cytokine cytokine receptor interaction”“ko04670：Leukocyte transendothelial migration”“ko04660：T cell receptor signaling pathway”等中。在细胞粘附相关信号通路中，差异表达基因主要集中在“ko04810：Regulation of actin cytoskeleton”“ko04510：Focal adhesion”“ko04530：Tight junction”“ko04520：Adherens junction”等中。同时，“ko04010 MAPK signaling pathway”“ko04012 ErbB signaling pathway”“ko04630 Jak STAT signaling pathway”等多个差异表达基因的信号通路参与细胞增殖、分化、迁移、存活等调控途径。而且，功能归类结果还显示与神经系统相关如“ko04360：Axon guidance”“ko04726 Serotonergic synapse”等，以及与胰岛素 糖尿病相关如“ko04910：Insulin signaling pathway”“ko04920：Adipocytokine signaling pathway”“ko04930：Type II diabetes mellitus”等两类信号通路。此外，归类时还发现存在多个与食源性致病菌相关的信号通路，如“ko05132：Salmonella infection”“ko05130：Pathogenic Escherichia coli infection”“ko05100：Bacterial invasion of epithelial cells”“ko05150：Staphylococcus aureus infection”等。

2.5 差异表达基因GO功能分析

豆豉样品处理组中240个显著差异表达基因的GO功能分析，主要包括免疫应答、细胞结构及功能调控、营养素代谢、神经传导及激素分泌调节等。结合表1中KEGG富集筛选出的各类典型信号通路的差异表达基因组成，选取其中最具有代表性的10个显著差异表达基因GO功能分析（表2）。其中，IL8、NFKBIA、ITGA6、F3、WNT5A均与免疫系统调控密切相关，VCL、FERMT2等参与了细胞骨架及细胞间粘附过程，PRKAR1A、PTPN11主要与胰岛素的分泌与调节相关，ACSL3则显示与脂质代谢有关。

2.6 差异表达基因（蛋白）相互作用

豆豉样品处理组中240个显著差异表达基因，经STRING10.5在线数据库筛查获得204个有效注释的基因（蛋白）数据，构建蛋白互作网络图。结果表明，IL8、VCL、NFKBIA等基因（蛋白）的节点度较高，与其他显著差异表达基因（蛋白）存在较多、较复杂的相互作用。

3 讨论

豆豉作为一种风味独特、营养丰富的传统发酵食品，从古至今向来都是餐桌上的常客。近年来，其优越的保健功能被广大科研工作者尤为关注。如冯薇等[8]发现，淡豆豉提取物成分具有促成骨细胞增殖活性。然而，过往对豆豉的研究还多着眼于其微生物群落多样性或组分活性评估[3 4，9 11]，对其摄入体内后与肠道的相互作用及其分子机制的研究尚属空白。前人已成功将RNA Seq技术应用于氧化鱼油影响草鱼肠道代谢通路的分子作用机制研究[12]。因此，本研究对与豆豉共孵育后肠上皮细胞进行RNA Seq筛查，分析差异表达基因的KEGG通路、GO功能和PPI途径，探索豆豉对肠道结构、功能和健康的分子作用机制。

RNA Seq結果显示，与豆豉共孵育后，Caco 2肠上皮细胞的基因表达水平发生明显的变化，其中240个基因发生显著差异表达（图1），表明二者间存在密切的互作机制。对差异表达基因参与的生化代谢和信号转导途径进行KEGG富集分析，主要集中在免疫应答、细胞粘附、细胞调控、新陈代谢相关等信号通路，表明豆豉作用于肠上皮细胞，对肠道正常生理功能和完整屏障结构的形成和发展存在广泛的影响。Woo等[13]发现，大麦和大豆混合发酵物能够减轻葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS）诱导结肠炎小鼠的炎症程度，抑制促炎细胞因子的水平，降低肠道通透性，提高紧密连接蛋白水平，恢复肠上皮细胞屏障功能[13]。Lee等[14]动物实验结果证实，摄食大豆发酵制品可同时增强体液免疫和细胞免疫功能。此外，大量研究表明，豆豉中富含的乳酸菌等可促进宿主肠道健康[3，15]。本研究还发现，如“Insulin signaling pathway”“Adipocytokine signaling pathway”“Type II diabetes mellitus”“Type I diabetes mellitus”等与胰岛素—糖尿病相关信号通路，或表明豆豉中组成益生菌及其益生代谢组分或通过调节胰岛素分泌及受体敏感度等方式改善肥胖和糖尿病。不少研究表明，豆豉或其提取物通过抑制α 葡萄糖苷酶活性、改善糖代谢和/或提高胰岛素敏感性等机制发挥降血糖功效[16 18]。课题组前期汪孟娟等[2]发现，豆豉水提物可较好地抑制α 葡萄糖苷酶活性，董素琴[1]则从豆豉中分离、鉴定出一株能显著降血糖的解淀粉芽孢杆菌，均证实稻香园豆豉具有防治2型糖尿病的潜力，与本研究结果一致。同时结果还显示，多个差异表达基因富集在神经系统相关信号通路，推测豆豉中微生物及其组分或以脑肠轴的形式作用于肠和中枢神经系统[19 20]。此外，差异表达基因归类时，存在多个与食源性致病菌相关的信号通路，包括“Salmonella infection”“Pathogenic Escherichia coli infection”“Bacterial invasion of epithelial cells”“ko05150：Staphylococcus aureus infection”等，或源于豆豉为自然条件下传统发酵，与环境、人员广泛接触，使得其微生物群落多样性复杂有关。如课题组前期研究均发现，葡萄球菌属、肠杆菌属广泛存在于稻香园豆豉中[3 4，9]。李晓然等[21]在豆豉细菌群落多样性进行高通量测序分析时，发现了福氏志贺氏菌（Shigella flexneri）序列。对显著差异表达基因进行GO功能分析，主要涉及免疫应答、细胞结构及功能调控、代谢及分泌调节等生物学过程。进一步构建蛋白互作网络图，结果表明，免疫相关的IL8[22]、NFKBIA[23]、细胞粘附相关的VCL[24]等几个基因（蛋白）互作参与程度较高。如Yakabe等[22]研究认为，IL 8分泌量增加有助于肠上皮细胞修复损伤及应对感染，而RNA Seq分析显示，IL8在豆豉与肠上皮细胞共孵育组中表达水平显著上调。

综上所述，本研究利用RNA Seq绘制了肠上皮细胞受豆豉作用的基因差异表达谱，主要涉及免疫应答、细胞粘附、胰岛素分泌、营养素代谢、细胞结构及功能调控、乃至与食源性致病菌相关的等多类别的基因功能和信号通路，为阐明豆豉摄食对肠道结构、功能和健康的分子作用机制提供科学依据。◇

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Differentially Expressed Genes of Intestinal Epithelial Cells Interacted with Jiangxi Douchi Based on RNA Seq

TAN Qiang lai 1，2，ZENG Zhen 1，2，WU Xiao li3，XU Feng4

（1Engineering Research Center of Natural Cosmeceuticals of Fujian Province，Xiamen Medical College，Xiamen 361023，China;2Engineering Research Center of Marine Biopharmaceutical Resource of Fujian Province，Xiamen Medical College，Xiamen 361023，China;3School of Basic Medical Science，Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang 330004，China;4Jiangxi OAI Joint Research Institute，Nanchang University，Nanchang 330047，China）

Abstract： Objective To investigate the differentially expressed genes（DEGs）of intestinal epithelial cells interacted with Douchi based on RNA Seq. Method After co incubation with water extract Douchi sample，the changes of DEGs of Caco 2 cells were surveyed using RNA Seq.The KEGG，GO，and PPI network analysis were investigated accordingly. Result A total of 17 892 DEGs，with 240 significantly DEGs（including 125 upand 115 down regulated expression）were obtained.KEGG results showed that 215 signaling pathways were annotated，which were involved in metabolism，immune system，cell regulation，cell adhesion，etc.GO results showed that the DEGs were mainly related to various biological processes of immune response，cell structure and function，nutrient metabolism，nerve conduction and hormone secretion.PPI network results showed that 204 DEGs were enrolled into STRING online database and interacted with each other.Furthermore，IL8，VCL，NFKBIA were considered to be hub genes with higher node degrees. Conclusion Jiangxi Douchi may cause multiple genes of intestinal cells differently expressed，which provides a basis to elucidate the molecular mechanism of Douchi and intestinal tract interaction.

Keywords：douchi;intestinal epithelial cell;RNA Seq;differentially expressed genes