PTEN/PI3K/AKT通路缓解糖尿病视网膜病变的机制

杨丽娜 方肖云

(浙江大学医学院附属第二医院，浙江 杭州 312500)

糖尿病视网膜病变是糖尿病最为严重、常见且对视力功能有严重影响的眼部并发症，是糖尿病患者致盲的主要原因之一〔1〕。视网膜病变后视神经元凋亡是导致患者视功能不佳甚至失明的主要原因，故找到一种抑制视网膜病变后光感受器细胞凋亡的方法，对改善糖尿病视网膜病变患者的视功能及降低失明风险意义重大〔2，3〕。研究发现，发育期的视网膜节细胞中有第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物基因(PTEN)优先定位〔4〕。PTEN参与神经元凋亡的过程，作为一种主要的神经元凋亡调节因素，PTEN具有蛋白磷酸酶与脂质磷酸酶双重活性，作为脂质磷酸酶时，可对磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(AKT)信号通路产生负性调控，抑制细胞生长，加速细胞凋亡〔5〕。Sun等〔6〕研究发现，将成年小鼠视网膜上PTEN基因敲除后，视神经损伤，但视网膜神经元活性增加，认为PTEN的失活是提高皮质神经元再生能力的主要原因。故推测抑制PTEN影响PI3K/AKT信号通路可能对缓解糖尿病视网膜病变有一定价值，但目前与之相关的研究并不多见。本研究探讨PTEN/PI3K/AKT信号通路缓解糖尿病视网膜病变的机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 购自甘肃中医药大学科研实验动物中心的50只SD大鼠，许可证号：SCXK(甘)2019-0001。大鼠周龄均为8 w，雌性25只，雄性25只，雌性与雄性分笼喂养；体重0.20～0.22〔平均(0.21±0.01)〕kg。

1.2主要实验设备与试剂 北京博爱科贸生物有限公司提供的链脲佐菌素、上海派普泰克生物制剂有限公司提供的内皮生长因子、美国Sigma公司提供的双过氧钒(bpV，PTEN特异性抑制剂)、美国Roche公司提供的TUNEL原位细胞凋亡检测试剂盒、上海华灵康复器械厂提供的高效切片石蜡、上海化学试剂公司提供的各类化学试剂，如多聚甲醛、二甲苯等、日本Olympus公司提供的荧光显微镜、光学显微镜，美国Cell Signaling公司提供的兔抗大鼠AKT单克隆抗体、p-AKT单克隆抗体，美国Abcam公司提供的兔抗大鼠B细胞淋巴瘤(Bcl)-2多克隆抗体、胞质细胞色素(Cyt)C多克隆抗体、磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP3)依赖性激酶(p-PDK)1多克隆抗体、鼠抗人半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3单克隆抗体及胞质蛋白制备试剂盒，其他细胞裂解液、蛋白浓度检测试剂盒等均由碧云天生物试剂提供。

1.3方法

1.3.1分组方法 SD大鼠50只，随机抽取10只作为空白对照组，其余40只作为模型组建立糖尿病视网膜病变模型，视网膜病变大鼠模型均为增殖期。建模后随机抽取10只大鼠纳入安慰剂组，为其视网膜下注射安慰剂，其他30只大鼠视网膜下注射bpV随机分为3组，bpV使用剂量分别为40 ng/kg、400 ng/kg、4 000 ng/kg。每组10只大鼠，动物的使用均符合视觉与眼科研究协会2014年年会提出的有关实验动物使用的相关条款〔7〕。全部大鼠在12 h白昼/12 h夜晚的环境下喂养，环境湿度55%～60%，温度：22～25℃。

1.3.2糖尿病视网膜病变建模方法 大鼠适应性喂养7 d后，模型组腹腔内注射60 mg/kg链脲佐菌素液，注射前禁食16 h，不禁水，注射3 d后检测空腹血糖值，若≥16.7 mmol/L则判定为糖尿病；在成功建立糖尿病模型后，使用微量进样器抽取内皮生长因子0.05 μg，于大鼠颞侧角膜后缘2 mm水平处经睫状体平坦部位向玻璃体腔内注射，进样器缓慢推进并留针10 s，28 d后分批对模型组进行眼底荧光造影检查，若造影结果显示血管扩张迂曲、背景荧光增强、新生血管荧光渗漏等影像学表现则视作发生糖尿病视网膜病变，且病变阶段为增殖期，成功建立糖尿病视网膜病变大鼠模型。

1.3.3模型组分组与给药方法 全部建模成功的40只大鼠中随机抽取10只纳入安慰剂组，在成功建模第4天为其视网膜注射安慰剂，其他30只大鼠均在视网膜下注射bpV，随机分为3组，剂量分别为40 ng/kg、400 ng/kg、4 000 ng/kg。

1.4相关指标的检测

1.4.1制备组织切片 模型制作后3 d，使用1%戊巴比妥钠向大鼠腹腔注射，处死大鼠，大鼠的处理符合中华人民共和国科学技术部“关于善待实验动物指导性意见”中的相关意见〔8〕。大鼠处死后在角膜12点位置处做好标记，并保留角膜缘球结膜，将其他部位球结膜去除，摘取眼球后放置在眼球固定液中，行脱水、包埋、视神经矢状切片等处理，切片厚度约为5 μm，用于免疫荧光染色操作。将分离得到的视网膜置于液氮内保存，进行Western印迹检测。标本进行脱水、透明、浸蜡、包埋等操作。

1.4.2主要检测指标与方法 结合免疫荧光与Western印迹法检测PTEN在建模后1 d、2 d、3 d、7 d的表达，同时使用荧光凋亡试剂盒检测视神经细胞元凋亡情况，严格按照试剂盒进行操作与判别。①免疫荧光检测p-AKT、p-BAD、Bcl-2：大鼠双眼球摘取后石蜡切片常规脱蜡，切片微波抗原修复，缓冲液冲洗，山羊血清内封闭，缓冲液冲洗，稀释孵育过夜，缓冲液冲洗孵育后过夜，复染后再次冲洗，脱水操作后进行透明、封片，在荧光显微镜下观察复染结果。②Western印迹检测视网膜p-PDK1、CytC、Caspase-3蛋白水平：配制组织裂解液、缓冲液，提取组织总蛋白，分离线粒体与胞质，配制所需液体后进行各项操作，使用软件检测Western条带灰度值，计算各蛋白内参β-actin灰度比值。③胞质处理后，采用酶联免疫吸附试验测定PIP3表达。

1.5统计学分析 采用SPSS20.0软件进行单因素方差分析检验、SNK-q检验。

2 结 果

2.1大鼠建模后各时点PTEN表达水平 空白对照组大鼠PTEN表达水平为0.39±0.02，模型组建模后PTEN表达逐渐上调，建模后1、2 d分别为0.69±0.10，0.81±0.12，在建模后3 d达到峰值，为0.92±0.04，后呈下降趋势，并在7 d(0.44±0.04)恢复至正常(F=232.456，P<0.001)。

2.2视神经元凋亡情况 空白对照组未检出视神经元凋亡。建模后第1天，在模型大鼠外核层(ONL)发现少量凋亡细胞；第2天、第3天模型组大鼠ONL可见视神经元凋亡增加，表达强度增强；在建模成功第4天给予大鼠视网膜bpV注射，建模第7天即bpV注射3 d，此时可见有视神经元凋亡数量减少，表达强度明显降低，见图1。

图1 各组视神经元凋亡情况(TUNEL，×100)

2.3各组p-AKT、p-BAD、Bcl-2、p-PDK1、CytC、Caspase-3表达比较 与空白对照组比较，安慰剂组、p-AKT、p-BAD、Bcl-2、p-PDK1、CytC及Caspase-3均明显降低(P<0.05)。与安慰剂组比较，bpV组p-AKT、p-PDK1、p-BAD、Bcl-2表达显著升高，胞质CytC、Caspase-3表达显著上调，且bpV 4 000 ng/kg组>bpV 400 ng/kg组>bpV 40 ng/kg组(P<0.05)。见表1。

表1 各组p-AKT、p-BAD、Bcl-2、p-PDK1、CytC、Caspase-3相对表达检测结果比较

3 讨 论

糖尿病视网膜病变的发生与发展是一个极为复杂的病理过程，引起这种病变发生的病理原因涉及信号传导代谢酶、细胞因子、炎症反应、离子通道等诸多基因异常改变〔9〕。新生血管形成是糖尿病视网膜病变进入增殖期的主要病理特征，故阻断新生血管的形成是目前糖尿病视网膜病变治疗的主要研究靶点〔10〕。

PI3K/AKT信号通路在细胞中广泛存在，主要作用是通过参与细胞的增殖、生长与分化调节来实现，该信号通路在激活的状态下可加速内皮细胞存活周期，同血管内皮生长因子相互作用，介导细胞的迁移、存活、诱导新生血管形成，是一种促存活信号通路〔11〕。AKT是丝氨酸抗凋亡主要信号，可以通过调节内皮细胞的细胞周期来介导细胞周期相关蛋白水解并帮助其在细胞内定位，达到干扰G1期向S期过渡的目的，发挥调节内皮细胞迁移、增殖及血管新生诱导之效〔12〕。而PI3K被激活后，则主要受其第二信使PIP3刺激，产生下游更多信号分子，增强信号通路传导，进一步增强PI3K通路在内皮细胞增殖、迁移、血管生成等病理改变中的作用〔13〕。周赛君等〔14〕研究结果发现，因高糖导致的缺氧缺血环境会激活内皮细胞内PI3K/AKT信号通路中AKT表达，增加其磷酸化，进而加速新生血管的形成。这种PI3K/AKT信号通路传导信号增强的机制，被认为可用于指导糖尿病视网膜病变的治疗〔15〕。神经元凋亡是诸多神经疾病包括视网膜病变在内的最终结局，可见抑制视神经元凋亡对缓解糖尿病视网膜病变患者病情与抑制病情进一步发展的关键意义〔16〕。PTEN是一个高度保守基因，在人与诸多哺乳动物中，其具有高度的同源性，可见PTEN在细胞生命中的关键作用〔17〕；PTEN作为一种脂质磷酸酶，可对PI3K/AKT信号通路产生负性调控，这种负性调控对细胞的生长有抑制作用，参与细胞凋亡〔18〕。

本研究结果提示PTEN表达增加可能介导了糖尿病视网膜病变大鼠视神经细胞的凋亡，可能是视网膜病变大鼠视功能逐渐减退的原因。故考虑抑制PTEN表达，可能对减轻视神经细胞凋亡、缓解疾病进一步进展有积极意义。结果表明抑制PTEN通路对阻碍糖尿病视网膜病变视神经元细胞凋亡有一定应用价值。糖尿病视网膜病变后抑制PTEN能够重新对PI3K/AKT信号通路活性产生直接激活的效果，增加p-BAD、Bcl-2等表达，发挥理想的视神经保护之效。