豁痰通络方对大鼠球囊损伤内膜增生ERK/JNK信号转导通路的干预机制

沈娟娟 褚颖 苏颖 胡亚男 聂金娜 路方平 王利锋 马金玲 王闻婧 田野

(长春中医药大学，吉林 长春 130117)

冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)是中老年人群高发疾病，介入治疗是主要治疗方法，但血管成形术后再狭窄的发病率不断增高，危害中老年患者健康，影响其治疗远期预后及人们的生活质量。血管再狭窄问题成为研究心血管领域的难点〔1,2〕。血管再狭窄进程中，血管平滑肌细胞异常增殖，新生内膜增厚是主要的环节〔3〕。多种因素刺激血管平滑肌细胞，多种细胞外信号转导通路被激活，从而影响细胞生长周期，引起血管平滑肌细胞增殖、转移及凋亡。在多种细胞外信号转导通路中，调节氨基末端蛋白激酶(JNK)、蛋白激酶(ERK)、p38 丝裂素活化蛋白激酶(p38 MAPK)信号通路被激活后，其调控作用显著〔4〕。所以干预血管平滑肌细胞增殖及凋亡相关调控信号转导通路成为影响经皮冠状动脉腔内血管成形术(PTCA)后再狭窄防治的重要切入点〔5,6〕。心脉痹阻成为冠心病主要病因病机，结合“心主血脉”理论，明确在血管重建术后再狭窄这个复杂的病理过程中，气滞、血瘀、痰浊、热毒四者互结是其主要的病机关键〔1〕。根据“心主血脉”理论，是否可以通过调节心之气血阴阳，从痰瘀伏络，蕴结成毒角度论治血管重建术后再狭窄，为解决冠心病血管重建术后再狭窄问题提供新思路。本文拟分析豁瘀通络方对大鼠球囊损伤内膜增生ERK/JNK信号转导通路的干预机制。

1 材料与方法

1.1实验材料 ①实验动物：北京维通利华实验动物技术有限公司提供SPF级雄性大鼠60只，动物合格证号：SCXK(京)2012-0001。②实验试剂：豁痰通络方(申请专利，保密)，长春中医药大学提供，生药含量2.33 g/ml。辛伐他汀片，远大医药中国有限公司，批号：H20000107。③实验器材：水平电泳仪(北京六一有限公司，DYCP-31CN)；数显翘板脱色摇床电泳(上海力辰邦西仪器科技有限公司，RS 1)；数显台式恒温摇床振荡器(上海助蓝仪器科技有限公司)〔1〕。

1.2制备模型 SD大鼠术前皮注低分子肝素钠抗凝1 h后进行造模〔7〕。麻醉大鼠后于左颈总动脉行球囊损伤术，术后给予青霉素及低分子肝素钠注射液进行抗炎、抗凝。假手术组不进行球囊损伤，只结扎左颈总动脉。

1.3实验分组 SD大鼠随机分为6组，其中假手术组、模型组给予蒸溜水灌胃，豁痰通络组给予1.633 g/ml灌胃；辛伐他汀组给予0.119 mg/ml灌胃；豁痰通络+辛伐他汀组给予中药组方1.633 g/ml、辛伐他汀0.119 mg/ml灌胃，术后次日灌胃给药，连续30 d。以上药物均按1 ml/kg体重配制给药。

1.4苏木素-伊红(HE)染色法检测大鼠颈动脉内膜增生 将石蜡常规包埋后，切片烘干常温保存备用。采用常规脱蜡、染色、脱水、封片。

1.5免疫组化染色法 根据免疫组化试剂盒说明常规操作(ERK 抗体效价1∶100)。免疫组化图像分析：棕黄色染色为阳性反应。ERK在胞质和胞核中表达。

1.6RT-PCR检测实验 取适量标本，充分研磨。常规提取总RNA，测定RNA浓度，进行逆转录反应，后进行PCR反应测定。白细胞介素(IL)-1β引物、正义：5′-CTC ATT GTG GCT GTG GAG AA-3′，反义：5′-GGG ATT TTG TCG TTG CTT GT-3′，特异性扩增片段为323 bp。IL-6引物：正义：5′-CAC AGA GGA TAC CAC CCA CA-3′，反义：5′-GAA CTC CAG AAG ACC AGA GCA-3′，特异性扩增片段为256 bp。β-actin引物，正义：5′-GCC GTC TTC CCC TCC ATC GTG-3′，反义：5′-TAC GAC CAG AGG CAT ACA GGG ACA AC-3′，特异性扩增片段为357 bp。PCR条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s；IL-1β退火温度为 55.7℃；IL-6退火温度为 58.8℃；β-actin退火温度为60℃，退火30 s； 72℃延伸45 s；72℃最后延伸7 min；共35个循环。进行凝胶电泳后用AlphaImager EP凝胶成像仪分析系统进行拍照和灰度分析。

1.7Western印迹实验 取冻存于液氮的血管标本，总蛋白提取后采用二喹啉甲酸(BCA)试剂盒测定浓度，配制10%分离胶，5%浓缩胶，设置恒压80 V，30 min后将电压设置为120 V(恒压)，90 min结束电泳。转膜设置恒定电流 400 mA，转膜90 min。采用脱脂奶粉进行室温封闭 120 min，加入一抗，p-ERK、p-p38、p-JNK1/2。25℃水浴箱中震荡孵育1 h后4 ℃过夜。二抗孵育按1∶400比例于25℃水浴箱中孵育2 h。应用Quaniityone凝胶图像分析计算积分光密度，以p-ERK、p-p38、p-JNK1/2蛋白与内参照β-actin蛋白积分光密度的比值表示p-ERK、p-p38、p-JNK1/2蛋白的相对含量。

1.8统计学方法 采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1HE染色法检测大鼠颈动脉内膜增生 模型组内膜明显增厚，平滑肌细胞排列紊乱显著增生，表明模型已经形成；与模型组比较，辛伐他汀组动物内膜增生显著缓解，豁痰通络组内膜增生减轻仍见排列紊乱；豁痰通络+辛伐他汀组动脉内膜增生显著减轻。见图1。

2.2免疫组化染色结果 在细胞质内可见p-ERK表达，活化后进入细胞核。细胞核见棕黄色，并见沉积的棕黄色颗粒为阳性反应。模型组可见明显棕黄色细胞核，豁痰通络、辛伐他汀组、豁痰通络+辛伐他汀组阳性着色与模型组比较显著改善。见图2。

图1 HE法检测血管内膜增生情况(HE，×100)

图2 免疫组化染色法检测血管ERK蛋白表达(DAB，×50)

2.3RT-PCR检测实验结果 与假手术组比较，IL-1β mRNA表达在模型组中极显著增高(P<0.01)，与模型组比较，豁痰通络组显著减少(P<0.05)，辛伐他汀组、豁痰通络+辛伐他汀组极显著减少(P<0.01)，与假手术组比较，IL-6 mRNA表达在模型组中极显著增高(P<0.01)，与模型组比较，豁痰通络、辛伐他汀组显著减少(P<0.05)，豁痰通络+辛伐他汀组极显著减少(P<0.01)，见表1，图3，图4。

表1 各组颈静脉组织IL-1β、IL-6 mRNA比较

1.假手术组；2.模型组；3.豁痰通络组；4.辛伐他汀组；5.豁痰通络+辛伐他汀组；下图同图3 RT-PCR检测IL-1β mRNA的表达

图4 RT-PCR检测IL-6 mRNA的表达

2.4Western印迹实验结果 对比模型组，豁痰通络组、辛伐他汀组均能够显著降低p-ERK1/2蛋白表达(P<0.05)，豁痰通络+辛伐他汀组较模型组比较极显著降低p-ERK1/2蛋白表达(P<0.01)。豁痰通络组、辛伐他汀组、豁痰通络+辛伐他汀组较模型组比较均能极显著降低p-p38、p-JNK1/2蛋白表达(P<0.01，P<0.05)。见表2，图5。

表2 各组颈静脉组织ERK1/2、P38、和JNK1/2蛋白表达比较

图5 各组ERK1/2、P38、JNK1/2蛋白表达

3 讨 论

血管内皮细胞在正常状态下排列紧密连续，能够通过有效抑制脂质堆积及炎症浸润，分泌抗凝血因子，起到抗血栓形成的作用〔8〕，血管成形术容易损伤血管内皮细胞，血管内膜被撕脱损伤，影响血管内皮细胞正常功能，出现过度自我修复及增殖，减少抗血栓形成因子的分泌，聚集激活血小板后，再次形成血栓〔9〕。经血管造影检测显示，多数患者存在血管再狭窄的风险。

3.1影响血管再狭窄形成的因素 基础因素：年龄，老年人群为此病证的高发群体，其血管弹性伴随着年龄增长呈下降趋势，血管内皮细胞失去连贯性，直接影响内皮细胞的正常功能，再生内皮细胞功能不稳定成熟，是血管再狭窄发生的年龄因素〔10〕。吸烟及肥胖可以加速冠状动脉粥样硬化的发展进程，也是血管再狭窄发生的重要影响因素。基础疾病例如糖尿病患者，血糖水平控制不佳直接影响血管再狭窄的发生发展〔11〕。炎症介质因素：炎症细胞被激活，与血管再狭窄的发生发展呈正相关作用，在血管内膜被机械损伤后，影响血管内皮细胞功能，内皮细胞分泌黏附因子，促使白细胞被活化，白细胞联合内皮细胞促进趋化因子及炎症因子过度产生，导致内皮细胞过度增殖，引发血管重塑，进一步促进血管在狭窄的发生〔12〕。肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-1及IL-6等细胞炎症因子可以和受体结合，活化细胞外多种信号转导通路〔13〕，例如ERK信号转导通路，ERK激活后磷酸化的ERK1/2再激活转录因子，能够刺激血管平滑肌细胞增殖并迁移，如此产生恶性循环效应，对血管再狭窄起到重要作用〔14〕。

血管内膜被机械损伤后，内皮细胞出现一系列变化，其中内皮生长因子、G蛋白受体、内皮面缚因子等活化后刺激细胞，激活细胞外多种信号转导通路，这些信号转导通路构成了复杂的网络，能够诱导内皮细胞增殖、迁移，释放血管紧张素-Ⅱ，且能够诱导细胞内的炎症反应〔15〕。

例如MAPK家族，其成员主要包括JNK、ERK1/2、p38及ERK5信号转导通路〔16〕。MAPK是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，主要存在于细胞内。MAPK可以将信号从细胞表面传递到细胞核，把细胞外信号传递到细胞内，对细胞的基因转录有非常重要的调控作用，影响细胞生长周期，导致细胞过度增殖、分化及迁移〔17〕。在MAPK家族中，最为经典的信号转导通路为JNK、ERK1/2、p38信号转导通路〔18〕。如果受到外界刺激，例如生长因子、细胞因子、渗透压等因素激活了JNK、ERK1/2、p38信号转导通路，使细胞内ERK/JNK的蛋白表达改变，活化后的ERK由细胞表面传导至细胞核，而JNK活化后将下游底物JNK等磷酸化，活化后的ERK/JNK对细胞增殖、生长、分化、迁移及凋亡等方面有重要的调节作用〔19〕。其中JNK对细胞的增殖、迁移及凋亡具有促进作用，而ERK1/2可以调控细胞的增殖迁移及凋亡，发挥保护作用〔20〕。

本研究发现，豁痰通络方可使内膜增生成度显著降低，并能够减少颈动脉组织中p-ERK1/2、p-p38、p-JNK1/2的蛋白表达。阐明中药豁痰通络饮能够减少球囊损伤后大鼠颈动脉血管炎症反应，抑制血管内皮增生。可能与抑制 ERK1/2、p38、JNK1/2信号通路相关。

3.2中医学理论认识血管再狭窄 中医学认为“心痛”“胸痹”等病证可以概括冠心病、心绞痛的理论范畴，其“心脉闭阻不通”是发病的重要机制〔21〕。中医认为“术后必伤气”、“术后必有瘀”〔22〕。气为血之帅，血为气之母，气虚无力推动血的运行，血行不畅，无力滋养人体，且日久易出现气滞血瘀，瘀血内阻，气机被阻滞，失于条达；进而影响津液输布，津液停聚成痰，痰湿阻滞气血运行，日久蕴结成为热毒。血管重建术是现今西医普遍应用的冠心病、心肌梗死的急救方案。因血管重建术会损伤血管内皮，形成血栓〔23〕，再次形成瘀血。瘀血阻遏气机运行，不能化气行水，津液内停形成痰饮，痰湿日久蕴结成为热毒。形成了气滞、血瘀、痰浊、热毒，四者又互为因果，久留不去，伏藏与人体脏腑中，若有内外因素干扰，必至血脉再次瘀阻〔24〕。

以上理论均体现伏邪致病的特点，伏邪潜藏于人体脏腑内，若人体正气充足，则不易体现〔25〕。血管重建术后患者大都病程较长，人体正气已经亏虚，如若收到内外因素干扰，例如感受四时不正之气，或情志刺激，劳倦过度，饮食失节等因素干扰，则易新感引动伏邪，必再次发病，并且病情进一步加重。