检测HLA-B27+/B7- 在诊断强直性脊柱炎中的临床价值

董玉兰，徐冉，余志宏，马亮

（景德镇市第一人民医院检验科，江西 景德镇333000）

强直性脊柱炎 （Ankylosing spondylitis，AS）是脊柱关节炎（Spondyloarthritis，SpA）常见的临床类型，以中轴关节受累为主，可伴有关节外表现，严重者可发生脊柱畸形和关节强直， 影响患者生存质量。多见于青壮年男性，20～30 岁发病较多。多数患者进展缓慢、病情隐匿，往往不能引起人们的重视。 该疾病的主要诊断依据临床症状和影像学检查，但在疾病早期骨骼未发生改变，影像学特征不是很明显如X 线还只是出现Ⅰ级或Ⅱ级改变，临床症状又与其他疾病非常相似难以区分， 因此容易发生漏诊和误诊。国内的流行病学表明，我国AS的发病率为0.2%～0.45%[1]，而临床上约90%的AS患者HLA-B27+/B7-阳性[1]。 因此，HLA-B27+/B7-的检测在该病的诊断和鉴别诊断中具有重要价值。流式细胞仪使用荧光素和单克隆抗体,可多参数同时测定，具有高灵敏度、特异性，并用计算机进行光信号的数据处理分析,提高了检测速度与统计分析的精确性,实现了单细胞的高效、特异性分析。标本之间、不同实验室之间重复性好,被广泛应用于人类白细胞抗原B27 的检测。 本研究旨在用流式细胞术检测HLA-B27+/B7-的表达,以及其在AS 诊断和鉴别诊断中的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2012 年6 月至2018 年1 月景德镇市第一人民医院门诊和住院AS 患者(AS组)82 例，其中男70 例，女12 例，年龄10～75 岁，平均34.6 岁；腰椎间盘突出症（lumbar intervertebral disc herniation，LDH）患者（LDH 组）50 例，其中男19 例，女31 例，年龄29～78 岁，平均52.8 岁；健康体检者（正常对照组）40 例,其中男34 例，女6例，年龄15～72 岁，平均35.8 岁，均为该院体检中心健康体检者。 所有患者均符合指南诊断标准，并经相关科室医生确认。

1.2 诊断标准 所有AS 患者均符合2010 年中华医学会风湿病学分会强直性脊柱炎诊断及治疗指南[2]的标准。所有腰椎间盘突出症患者均符合2015年安徽省腰椎间盘突出症分级诊疗指南[3]的标准。

1.3 纳入标准 ⑴诊断明确， 病历资料完善者；⑵健康体检者心、肝、肺、肾、眼等功能基本正常。 ⑶研究对象签署知情同意书并积极配合检查。

1.4 排除标准 符合下列条件之一者即排除：⑴临床资料不全者；⑵妊娠或哺乳期妇女；⑶合并有其他疾病引起的精神及行为异常者;⑷不符合纳入标准者。

1.5 仪器与试剂 仪器采用美国贝克曼公司的Beckman-Coulter FC500 流式细胞仪, 单克隆抗体HLA-B27-FITC/HLA-B7-PE、IgG2a-FITC/IgG1-PE、 溶血素、 鞘液均来自贝克曼公司的标准试剂盒。

1.6 方法 清晨空腹采集EDTA-K2 抗凝静脉血2ml，取2 支流式专用管，做好标记，一支为同型对照管，另一支为测定管，向两管各加入全血50μl，然后向同型对照管加入IgG2a-FITC/IgG1-PE 试剂10μl，测定管加入HLA-B27-FITC/HLA-B7-PE 试剂10μl， 振荡混匀后室温避光孵育15～20min，然后依次向各管中加入溶血素500μl，混匀后室温避光孵育10min， 待完全溶血后500×g 离心5min,弃上清。加入500μl PBS 洗涤一次，500×g 离心5min，弃上清。 加500μl 含1%多聚甲醛的PBS 悬浮细胞，混匀后上机检测或置于4～8℃冰箱待测。

1.7 质量控制 实验前进行光路、流路的校正和荧光补偿，设置阴性对照管。 用标准荧光微球进行仪器校准。

1.8 统计学处理 数据分析采用SPSS19.0 统计软件,计数资料用百分率表示,组间比较采用χ2检验，P<0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 获取数据 采用流式细胞仪自带的软件获取数据并进行分析。 如图1 所示，先通过FS-SS 双参数图圈定淋巴细胞设门,区分经溶血素裂解红细胞处理后外周血白细胞中淋巴细胞、 单核细胞和粒细胞三个群体。 获取5000 个淋巴细胞，然后再分析5000 个淋巴细胞中HLA-B27+/HLA-B7-细胞群的百分比和荧光强度见图2，如果大于或等于仪器设定的界值报告阳性，否则报告阴性。

图1 通过FS Lin/SS Lin 双参数图圈定淋巴细胞设门

图2 淋巴细胞中HLA-B27+/B7- 细胞群的荧光强度和百分比

2.2 AS 患者的年龄及性别分布情况 AS 患者中男性多于女性，男女比例为5.8:1，其中以青壮年男性（<40 岁）的发病率最高，占61.0%，见表1。

表1 AS 患者的年龄及性别分布情况[n(%)]

2.3 HLA-B27+/B7-阳性率比较 AS 组HLA-B27+/B7-的阳性率为89.0%(73/82),显著高于LDH 组（P<0.01）和正常对照组的阳性率（P<0.01）。 而对照组与LDH 组之间的阳性率差异无统计学意义 （P>0.05），见表2。

表2 AS 患者、LDH 患者与健康体检者HLA-B27+/B7- 的阳性率比较

2.4 采用流式细胞仪检测HLA-B2 7+/B7-的各项临床评价指标 HLA-B27+/B7-检测对诊断AS 的灵敏度为89.0%( 73/82) ,特异度为95.0%( 38/40)，阳性预测值为97.3%（73/75）， 阴性预测值为80.9%（38/47），阳性似然比为17.8，阴性似然比为0.1，见表3。

表3 各项临床评价指标结果

3 讨论

HLA-B27 作为免疫遗传标记抗原, 几乎表达于所有有核细胞表面上，特别是淋巴细胞表面，在免疫系统中主要负责细胞之间的相互识别,诱导免疫反应和调节免疫应答。 HLA-B27 分子可以和一些自身肽段结合,形成复合体在自身细胞膜上表达后，能被相应的CD8+T 细胞识别，从而导致T 细胞对自身靶细胞的杀伤，造成组织变性、器官受损[4]。本研究中对82 例确诊AS 患者用FCM 进行HLAB27+/B7-检测分析后发现, 受检者中男女之比为5.8:1(70/12)，且小于40 岁男性占61.0%，说明AS主要在青壮年男性发病率高,这与流行病学资料相一致，也有认为可能是女性患者病情相对更缓和，临床医生对女性患者的认识不足,还有研究认为女性在HLA-B27 阴性的AS 患者中显示出更高的比例[5]。 本研究发现有一对AS 患者父女HLA-B27+/B7-检测都为阳性, 另有一例患者明确有强直性脊柱炎家族病史, 提示本病发病机制可能与遗传有关。 又有研究表明大约10%HLA-B27 阳性AS 患者的一级亲属将来会发展为AS[6]，并且HLA-B27阳性AS 患者其发病年龄早、症状重，预后及转归均较差[7]，因此临床上有必要对HLA-B27 阳性的一级亲属开展HLA-B27+/B7-的检测。 根据最近的研究表明,TREML2（表达在骨髓细胞激发受体家族成员之一） 基因的突变是一个导致散发和家族中HLA-B27 阳性AS 病人的主要因素。 更者，TREML2 可能会作为AS 的一个易感基因。 这些发现提供了一个更好地理解AS 发病的分子机制和新的治疗靶点[5]。

本研究中HLA-B27+/B7-检测对诊断AS 的灵敏度为89.0%( 73/82),特异度95.0%( 38/40) 。 阳性预测值为97.3%（73/75）,阴性预测值为80.9%（38/47），阳性似然比为17.8，阴性似然比为0.1。 显示AS 与HLA-B27+/B7-成正相关。 值得注意的是，82例确诊为AS 患者有9 例为HLA-B27+/B7-结果阴性,同样的,50 例LDH 患者有3 例HLA-B27+/B7-结果阳性以及40 例健康体检者也有2 例HLA-B27+/B7-结果阳性，因此AS 的诊断必须结合临床症状、X 线及其他检查综合做出分析。 虽然根据1984 年修订的纽约标准HLA-B27 阳性不能作为AS 的诊断依据，但随着人们对疾病的不断认识，2009 年及2011 年国际脊柱关节炎专家评估协会（ASAS），先后提出了中轴型和外周型SpA 新的脊柱关节炎分类，尤其是更加强调了HLA-B27 阳性对诊断中轴型SpA 的重要性[7]，将HLA-B27 阳性纳入诊断中轴型SpA 的指标之一。 基于这种情况，若患者临床上有腰骶髂关节部疼痛症状，X 线检查阴性，而HLA-B27 检测阳性, 应高度警惕处于强直性脊柱炎发病早期。

临床上AS 表现复杂多样，患者第一次就诊时最容易被误诊为腰椎间盘突出症[8],这是临床上比较多见的需要对这两种疾病进行鉴别。 虽然炎性腰背痛是AS 病变过程中的典型临床特征，但并非所有AS 患者的首发症状。 炎性背痛滞后的出现加上早期X 线的不典型表现以及现代生活方式的改变使得很多AS 患者就诊时被误诊为腰椎间盘突出症引起。 根据马骁等强直性脊柱炎误诊情况分析，易误诊的前五种疾病为腰椎间盘突出、腰肌劳损、类风湿关节炎、坐骨神经痛、风湿性关节炎[8]。本次研究中AS 患者阳性率为89.0%,而50 例LDH患者,只有3 例HLA-B27+/B7-阳性,阳性率为6.0%,两组患者阳性率具有显著差异（P<0.01）；另外根据林蔚等的研究发现AS 患者HLA-B27 阳性率为85.7%，高于RA 患者（P<0.05）[4]，也说明了HLAB27 检测可以作为鉴别相关疾病的一项重要指标。AS 关节外表现可累及眼部、 肠道和肾脏等多系统[9]。本次研究有四例确诊AS 患者来自眼科，并都是单眼并发葡萄膜炎（虹膜睫状体炎），且均为男性。HLA-B27 阳性与葡萄膜炎有着密切的关系已得到明确证实[10,11]。 由于AS 患者的眼部症状容易复发，且可导致患者致盲等严重后果,因此对于眼部疾病症状先于关节病变症状出现的患者, 在临床诊断中，HLA-B27 应作为一项排除强直性脊柱炎的筛查指标,以便早期发现强直性脊柱炎并针对性地对患者进行治疗，具有重大的临床意义[12]。

流式细胞术法所用的单克隆抗体在检测HLA-B27 时会与其它HLA 抗原 （特别是HLAB7）发生交叉反应，对检测结果造成影响。 目前，国内常用的Beckman-Coulter 有商品化的HLA-B27-FITC/HLA-B7-PE 双标单克隆抗体试剂，本研究使用这种方法对HLA-B27/B7 进行分析,同时分析荧光阳性百分率和平均荧光强度,可以大幅度提高检测灵敏度和特异性,减少HLA-B7 交叉反应可能会引起的HLA-B27 假阳性[1]。 同时FCM 抗原检测方便快捷，操作简单，能够快速检测大量细胞,极大地节约了分析时间，是临床筛查AS 的理想方法。 虽然也有研究采用PCR-SBT 分型方法对AS 患者及健康对照人群检测HLA-B27 基因主要致病亚型及可能的保护亚型,对于症状体征不典型患者和疑难患者的诊断和鉴别诊断具有一定价值[13]，尤其是对处于临界值抗原弱表达的判断可提高检测的准确性。 但PCR 方法对操作人员和实验条件的要求比较高,因此目前国际上普遍采用流式细胞术检测人类白细胞抗原B27。

综上所述, 用流式细胞术来检测HLA-B27+/B 7-的表达,其灵敏度和特异性具有较高的临床适用性，结合临床症状和影像学检查，不仅可以提高诊断AS 的准确性, 还可以作为早期诊断AS 和鉴别诊断的指标，让更多的患者得到早期诊断，尽早进行预防或及时治疗。 对于临床高度疑似AS 而HLA-B27+/B7-检测阴性的患者，应加强长期随访，以减少漏诊和误诊。