CSF2基因对舌鳞状细胞癌TCa8113细胞系化疗敏感性的影响

林阿随 蒋萍 沈耀川 谢晓梅 陈昕

【摘要】 目的：探究集落刺激因子2（colony stimulating factor 2，CSF2）對舌鳞状细胞癌TCa8113细胞系化疗敏感性的影响。方法：全转录组测序分析顺铂耐药TCa8113细胞（TCa8113/CDDP）与野生型TCa8113（WT-TCa8113）表达谱，并做差异基因分析。以TCa8113/CDDP细胞株上调程度最高的CSF2基因为候选耐药基因，通过构建该基因敲低、过表达TCa8113细胞株，探究CSF2对TCa8113细胞对顺铂敏感性的影响。结果：全转录组测序结果共筛选出2 077个差异基因，包括1 488个上调基因，589个下调基因。其中，CSF2是TCa8113/CDDP细胞株上调程度最高的基因。细胞毒性试验结果提示，WT-TCa8113细胞毒染48 h的半数抑制浓度（IC50）为（0.502±0.030）μg/ml，显著低于TCa8113/CDDP的（6.956±0.370）μg/ml

（P<0.01）。TCa8113/CDDP细胞的耐药指数（RI）为（13.8±1.34）。CSF2敲低TCa8113/CDDP和CSF2过表达TCa8113/CDDP细胞IC50分别为（0.774±0.120）μg/ml和（9.548±0.550）μg/ml，差异有统计学意义（P<0.01）。结论：CSF2是舌鳞状细胞癌顺铂耐药相关基因，抑制CSF2表达能显著提高TCa8113顺铂敏感性。

【关键词】 集落刺激因子2 舌鳞状细胞癌 顺铂 耐药 化疗敏感性

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2020.17.072 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2020）17-0-04

Effect of CSF2 Gene on Chemosensitivity of Tongue Squamous Cell Carcinoma TCa8113 Cell Line/LIN Asui， JIANG Ping， SHEN Yaochuan， XIE Xiaomei， CHEN Xin. //Chinese and Foreign Medical Research， 2020， 18（17）： -174

[Abstract] Objective： To investigate the effect of colony stimulating factor 2 （CSF2） gene on chemosensitivity of tongue squamous cell carcinoma TCa8113 cell line. Method： Cisplatin-resistant TCa8113 cells （TCa8113/CDDP） and wild-type TCa8113 （WT-TCa8113） expression profiles were analyzed by whole transcriptome sequencing， and the differential gene were analyzed. The CSF2 gene with the highest degree of up-regulation of TCa8113/CDDP cell line was used as a candidate drug resistance gene. By constructing this gene knockdown and overexpressing TCa8113 cell line， the effect of CSF2 on the sensitivity of TCa8113 cells to Cisplatin was explored. Result： The whole transcriptome sequencing results screened out 2 077 differential genes， including 1 488 up-regulated genes and 589 down-regulated genes. Among them， CSF2 was the most up-regulated gene of TCa8113/CDDP cell line. The results of cytotoxicity test indicated that the half inhibitory concentration （IC50） of WT-TCa8113 after 48 hours of infection was （0.502±0.030） μg/ml， which was lower than （6.956±0.370） μg/ml of TCa8113/CDDP cells （P<0.01）. The drug resistance index （RI） of TCa8113/CDDP cells was （13.8±1.34）. IC50 of CSF2 knockdown TCa8113/CDDP and CSF2 overexpression TCa8113/CDDP cells were （0.774±0.120） μg/ml and （9.548±0.550） μg/ml， and the difference was statistically significant （P<0.01）. Conclusion： CSF2 is a Cisplatin resistance-related gene of tongue squamous cell carcinoma. Inhibiting CSF2 expression can significantly increase the sensitivity of TCa8113 to Cisplatin.

[Key words] Colony stimulating factor 2 Tongue squamous cell carcinoma Cisplatin Drug resistance Chemosensitivity

First-authors address： The 73rd Military Hospital of the PLA， Xiamen 361000， China

口腔鳞状细胞癌是口腔癌中最常见的肿瘤类型，占所有口腔恶性肿瘤的90%以上[1-2]。其中，以舌鳞状细胞癌（tongue squamous cell carcinoma，TSCC）最为常见[3-4]。近年来多采用术前联合化疗方案以提高手术成功率，减少术后复发。但是，不同个体对相同化疗方案表现出的疗效差异较大[5-6]。化疗耐药是TSCC治疗失败的最主要原因[7-8]。目前，顺铂耐药分子机制仍未完全阐明[9]。本研究通过比较顺铂耐药人舌鳞癌TCa8113细胞株（TCa8113/CDDP）和野生型TCa8113（WT-TCa8113）细胞株的差异表达基因，筛选出CSF2为TCa8113/CDDP与WT-TCa8113细胞表达差异最大的基因。但目前仍未有CSF2基因对TCa8113細胞化疗敏感性的相关报道，故本研究通过构建CSF2敲低、过表达TCa8113细胞株进一步探究CSF2对TCa8113对顺铂敏感性的影响，为逆转舌鳞状细胞癌顺铂耐药提供参考。

1 资料与方法

1.1 主要试剂与仪器

DMEM培养基（Thermo Fisher Scientific）;胎牛血清（FBS）;全自动细胞计数仪（Thermo Fisher Scientific）;全蛋白提取试剂盒（杭州弗德生物科技有限公司）;鼠源性CSF2抗体（上海雅酶生物科技有限公司）;HRP标记二羊抗鼠抗体（上海雅酶生物科技有限公司）;高速离心机（beckman coulter，Allegra X-30）;恒温细胞培养箱（Thermo Fisher Scientific）。

1.2 细胞系及细胞培养

野生型人舌鳞状细胞癌细胞系TCa8113（WT-TCa8113）、顺铂耐药TCa8113（TCa8113/CDDP）购买于上海语纯生物科技有限公司。CSF2敲低WT-TCa8113（KD-WT-TCa8113）、CSF2过表达WT-TCa8113（OE-WT-TCa8113）、CSF2敲低TCa8113/CDDP（KD-TCa8113/CDDP）和CSF2过表达TCa8113/CDDP（OE--TCa8113/CDDP）由厦门闽博生物技术有限公司构建。上述细胞株均使用10% FBS和1%链霉素和青霉素的DMEM培养基于37 ℃、5% CO2的恒温细胞培养箱中培养。

1.3 顺铂耐药细胞株的鉴定

取对数生长期的WT-TCa8113和TCa8113/CDDP，胰蛋白酶消化后用新鲜培养基稀释至1×105/ml，接种于24孔板中培养6 h。待细胞完全贴壁后，更换含有梯度浓度的顺铂的新鲜DMEN培养基，浓度梯度设置为0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、4、8、10 μg/ml。培养48 h后采用全自动细胞计数仪计数各处理组的活细胞数量，以未加药组（0 μg/ml）为对照组，根据公式[细胞存活率=各梯度浓度处理组活细胞数量/对照组（0 μg/ml）活细胞数量×100%]计算各处理的细胞存活率。根据细胞抑制曲线计算WT-TCa8113和TCa8113/CDDP的半数抑制浓度（IC50）。耐药指数（RI）计算公式为：耐药细胞系的IC50/野生型细胞系的IC50。

1.4 野生型TCa8113和顺铂耐药TCa8113全转录组测序及表达谱分析

将上述经过鉴定的WT-TCa8113和TCa8113/CDDP送于上海天昊生物科技有限公司进行高通量转录组测序。mRNA表达量计算经比对、比较、标准化三个过程。利用HTSeq计算Read Count值。mRNA表达量以RPKM（reads per kilobase per million mapped reads）表示。分析WT-TCa8113和TCa8113/CDDP的差异表达mRNA，以|log2FoldChange|≥1，调整后P值<0.05为差异表达基因。最后，对差异表达的基因进行KEGG Pathway富集分析及人类基因功能（Gene Ontology，GO）富集分析，分析差异表达基因参与的生物学过程和通路，寻找可能的作用机制。P<0.05为筛选阈值。

1.5 WesternBlot检测细胞CSF2蛋白表达量

取指数生长期细胞，胰蛋白酶消化后，PBS重悬制备细胞悬液。全蛋白提取试剂盒提取细胞全蛋白后Western Blot试验检测各细胞CSF2蛋白表达量。

1.6 统计学处理

实验数据均采用SPSS 20.0软件进行统计分析，计量资料以（x±s）表示，两组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。细胞的半数抑制浓度（IC50）由Graphpad Prism v8.2软件计算，统计图均采用Graphpad Prism v8.2统计学软件制作。

2 结果

2.1 WT-TCa8113和TCa8113/CDDP细胞株对顺铂敏感性分析

梯度浓度（0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、4、8、10 μg/ml）顺铂培养基培养48 h后，WT-TCa8113和TCa8113/CDDP细胞株的细胞存活率随着顺铂浓度的增加而逐渐降低，见图1。WT-TCa8113细胞株的IC50为（0.502±0.030）μg/ml，显著低于TCa8113/CDDP细胞株的（6.956±0.370）μg/ml，差异有统计学意义（t=-30.114，P<0.01）。TCa8113/CDDP细胞的耐药指数（RI）为（13.80±1.34）。

2.2 WT-TCa8113和TCa8113/CDDP细胞株基因差异表达分析

通过生物信息学方法，共筛选出差异表达基因2 077个，其中TCa8113/CDDP上调基因1 488个（右上区域），下调基因589个（左上区域），见图2。根據差异倍数进行排序。TCa8113/CDDP对比WT-TCa8813，表达量差异最大的上调基因分别为CSF2、NMES1、NOG、SERPINB13、TCRP1、DKK1、FGD3、MMP11、PTHL、HSPP1;表达差异最大的下调基因分别为KRT4、CRNN、MUC21、MAL、ACTA1、TGM3、KRT13、CRISP3、MYL1、SPRR3。

2.3 CSF2敲低、过表达细胞株CSF2蛋白表达量检测

WesternBlot试验检测6株TCa8113细胞CSF2蛋白表达水平，顺铂耐药株TCa8113/CDDP的CSF2蛋白表达量较野生型WT-TCa8113高，见图3A。对3次独立试验的结果做半定量灰度分析显示，在WT-TCa8113组中，OE-WT-TCa8113 CSF2蛋白表达量较WT-TCa8113高，KD-WT-TCa8113 CSF2蛋白表达量较WT-TCa8113低，差异均有统计学意义（P<0.01）;在TCa8113/CDDP组中，OE-TCa8113/CDDP CSF2蛋白表达量较TCa8113/CDDP高， KD-TCa8113/CDDP CSF2蛋白表达量较TCa8113/CDDP低，差异均有统计学意义（P<0.01），见图3B。

2.4 CSF2表达对TCa8113细胞顺铂敏感性的影响

细胞毒性试验结果显示，WT-TCa8113、KD-WT-TCa8113和OE-WT-TCa8113的IC50分别为（0.543±0.040）、（0.327±0.020）、（3.500±0.320）μg/ml，KD-WT-TCa8113的IC50显著低于WT-TCa8113，OE-WT-TCa8113的IC50显著高于WT-TCa8113，差异均有统计学意义（P<0.05），见图4A。TCa8113/CDDP、KD-TCa8113/CDDP和OE-TCa8113/CDDP的IC50分别为（6.539±0.470）、（0.774±0.120）、（9.548±0.550）μg/ml，

KD-TCa8113/CDDP的IC50显著低于TCa8113/CDDP，OE-TCa8113/CDDP的IC50显著高于TCa8113/CDDP，差异均有统计学意义（P<0.05），见图4B。

3 讨论

本研究，通过分析人舌鳞状细胞癌TCa8113及顺铂耐药TCa8113的全转录组的表达差异，筛选出CSF2基因在耐药TCa8113细胞中表达高度上调，故考虑其为潜在的顺铂耐药相关基因。目前，CSF2对舌鳞状细胞癌的发生、发展仍未见报道。本研究首先采用WesternBlot试验检测野生型TCa8113与顺铂耐药株的CSF2表达情况，结果提示，顺铂耐药株CSF2表达量较野生型TCa8113明显升高。通过构建CSF2敲低、过表达细胞株，进一步验证筛选出来的候选基因对舌鳞状细胞癌TCa8113细胞系的影响。本研究首次报道敲低CSF2能显著提高野生型TCa8113顺铂化疗敏感性。不仅如此，对于顺铂耐药TCa8113/CDDP细胞株，敲低CSF2后，也可显著提高其顺铂敏感性，即可实现耐药逆转。

目前，已有数篇研究表明，高表达CSF2与肿瘤的进展有关[10-14]。例如，Lee等[10]报道，CSF2在尿路上皮癌中高表达，高表达CSF2的尿路上皮癌患者预后更差。Jiang等[11]发现，在胃癌中，高表达CSF2能促进肿瘤增殖、迁移和血管生成，与预后不良有关。Lawicki等[14]发现，三阴性乳腺癌的CSF2表达较非三阴性乳腺癌高。三阴性乳腺癌组织通过分泌CSF2，促进巨噬细胞在乳腺癌组织中的聚集，从而进一步促进三阴性乳腺癌的侵袭性。然而，据笔者所知，目前仍未有CSF2基因在舌鳞状细胞癌中的表达及其表达对舌鳞状细胞癌发生、发展相关性的研究。本研究初步鉴定了CSF2基因与舌鳞状细胞癌顺铂耐药相关，后续将进一步探究CSF2参与舌鳞状细胞癌发生、发展及对顺铂耐药的分子机制，为逆转舌鳞状细胞癌顺铂耐药的基础研究及临床应用提供理论依据。

参考文献

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[2] Hill S J，DAndrea A D.Predictive potential of head and neck squamous cell carcinoma organoids[J].Cancer Discovery，2019，9（7）：828-830.

[3] Almangush A，Heikkinen I，M?kitie A A，et al.Prognostic biomarkers for oral tongue squamous cell carcinoma：a systematic review and meta-analysis[J].British Journal of Cancer，2017，117（6）：856-866.

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