GC-MS法测定山茶油中脂肪酸组成

郑娟梅，王 警，陈宁周，莫紫梅，王海波

(广西-东盟食品药品安全检验检测中心，广西 南宁 530021)

山茶油又名野山茶油、茶籽油等，为山茶科山茶属油茶树的种子压榨而得的植物油。茶籽的含油率约为干重的25%～35%。山茶油中油酸和亚油酸含量高达80%，其脂肪酸的组成和比例与橄榄油相近，有“东方橄榄油”之美称[1]。我国是世界上最大的山茶油生产基地，其主要分布在广西、江西、湖南。

气相色谱法(GC)、拉曼光谱法、高效液相-质谱法(HPLC-MS)、超高效液相色谱-蒸发光散射检测法(UPLC-ELSD)等是脂肪酸类成分定性、定量检测常用的分析方法，但这些方法存在一定局限性，对于成分复杂、存在多种同分异构体、含量较低的脂肪酸，其分析效能不能令人满意。本研究建立54种脂肪酸的GC-MS定性定量分析方法，以期能对一些脂肪酸的同分异构体进行识别，并考察山茶油中脂肪酸的成分及含量，为山茶油的加工企业提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

54种脂肪酸甲酯标准品，纯度≥99.0%，购自BePure公司；甲醇、正庚烷，色谱纯，默克股份有限公司；异辛烷、正己烷、乙醚、无水硫酸钠、硫酸氢钠、氢氧化钾，AR，国药集团化学试剂公司；所有试剂除标注外，均为分析纯。

山茶油：购于广西巴马长寿之都健康食品有限公司。

1.2 仪器与设备

GCMS-TQ8040气相色谱三重四级杆质谱联用仪，日本岛津公司；S300H型超声清洗仪，德国Elmasonic公司；电子分析天平，德国赛多利斯公司；高速离心机，德国Sartorius公司；Milli-Q超纯水机，美国Milli-pore公司。

1.3 方法

1.3.1溶液的配制

分别精密称取54个标准品50.00 mg置10 ml容量瓶中，用正庚烷定容至刻度，其浓度为5.00 mg/ml，作为标准储备液，密封后置于-10℃以下冰箱，有效期3个月。

1.3.2样品前处理

精密称取样品100 mg 于25 ml 比色管中，加入5 ml正己烷溶解试样，振摇2 min，试样溶解后加入0.5 mol/L KOH-甲醇溶液0.5 ml，摇匀，40℃超声波处理20 min；加5 ml纯水于比色管中，反复摇匀；转移至离心管中，在25℃下10 000 r/min 离心3 min；吸取上层脂肪酸甲脂，加入2.0 g无水硫酸钠干燥，振摇混匀静置，取上清液过0.22 μm有机相滤膜，置于进样小瓶中进行GC-MS分析[2]。

1.3.3分析条件

色谱条件：色谱柱，TR-FAME(100 m×0.25 mm×0.2 μm)；载气，氦气(99.999%)；流速，1.0 ml/min；进样量，1.0 μl，分流比，10∶1；进样口温度，250℃；程序升温，80℃保持2 min，以30℃/min速率升温至140℃，保持1 min，以2℃/min速率升温至240℃，保持5 min。

质谱条件：EI电离方式；采集方式，Q3 Scan；质量扫描范围m/z为40～450；离子源温度：220℃；接口温度：250℃；溶剂延迟：5.5 min。获得的质谱数据通过 NIST 14 质谱图库进行检索，根据保留时间来确定各组分种类，并采用面积归一化法计算各组分含量。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理的优化

2.1.1甲酯化方法的选择

脂肪酸甲酯化常用方法有如下几种：硫酸-甲醇法、KOH-甲醇法、三氟化硼-甲醇法等，其各有优缺点，适用范围和测定结果各不同。硫酸-甲醇法一般用于游离型和甘油三酯型脂肪酸；KOH-甲醇法一般适用于甘油三酯型；三氟化硼-甲醇法与前2种方法相比步骤繁琐，操作复杂，而且溶液毒性较强，易于挥发，因此本研究不选择此法。当采用KOH-甲醇法时，检测出山茶油中含有11种脂肪酸，各组分能很好的分离。当采用硫酸-甲醇法时，检测出山茶油中含有9种脂肪酸，有可能是脂肪酸在酸性条件下与甲醇发生了酯化反应，但体系中有水的存在抑制其反应进一步发生的可能[3]。结果表明，样品在碱性条件下萃取，经甲酯化处理后，能有效的减少长碳链脂肪酸在高温下的裂解的情况[4]，为了检测山茶油中更多种脂肪酸的种类，我们选择KOH-甲醇法对山茶油进行甲酯化。

2.1.2甲酯化催化剂浓度的选择

精密称取样品100 mg于25 ml比色管中，加入5 ml正己烷溶解试样，振摇2 min，试样溶解后分别加入0.2、0.5、0.8、1.0、2.0和4.0 mol/L KOH-甲醇溶液，后续操作按1.3.2进行，结果见图1。

图1 KOH-甲醇溶液浓度对甲酯化的影响

由图1可知，随着KOH-甲醇溶液浓度的增加，总峰面积先增后减，当KOH-甲醇溶液浓度为0.5 mol/L时总面积最大。这是因为KOH-甲醇溶液浓度低于0.5 mol/L时，脂肪酸未完全甲酯化；当KOH-甲醇溶液浓度高于0.5 mol/L时，会引起脂肪酸甲酯皂化。故选用0.5 mol/L的KOH-甲醇溶液作为甲酯化催化剂。

2.1.3甲酯化温度的选择

精密称取样品100 mg 于25 ml比色管中，加入5 ml正己烷溶解试样，振摇2 min，试样溶解后加入0.5 mol/L KOH-甲醇溶液0.5 ml，摇匀，超声温度依次为20、30、40、50、60℃，超声波处理20 min，后续操作按1.3.2进行，结果见图2。

图2 超声温度对甲酯化的影响

由图2可知，超声温度为40℃时，脂肪酸总峰面积达到最大，且分离效果最好。这是因为当温度低于40℃时，脂肪酸甲酯化不完全，当温度高于40℃时，脂肪酸甲酯化会发生皂化等副反应，造成总峰面积的减少[5]，故选用40℃作为甲酯化的超声温度。

2.1.4甲酯化时间的选择

精密称取样品100 mg 于25 ml比色管中，加入5 ml正己烷溶解试样，振摇2 min，试样溶解后加入0.5 mol/L KOH-甲醇溶液0.5 ml，摇匀，40℃超声处理时间分别为10、20、30、40 、50 min，后续操作按1.3.2进行，结果见图3。

图3 超声时间对甲酯化的影响

由图3可知，当超声时间为20 min时，脂肪酸总峰面积达到最大，超声时间超过20 min后，皂化等副反应的发生，破坏了这种平衡，则脂肪酸总峰面积减少，故选用超声甲酯化的时间为20 min。

2.2 GC-MS条件优化

2.2.1色谱柱的选择

本研究为了获得最大的峰容量与分离度，对GC-MS中的色谱柱进行选择，因要考虑54种脂肪酸都能达到很好的分离效果，故我们选择了CP-Sil 88(50 m×0.25 mm×0.2 μm)、CP-Sil 88(100 m×0.25 mm×0.2 μm)和TR-FAME(100 m×0.25 mm×0.2 μm)3根柱子进行探讨。柱长度增加一倍，分离度提高一倍以上，碳链越短，出峰越快；饱和脂肪酸甲酯先出峰，不饱和脂肪酸甲酯后出峰；反式先出峰，顺式后出峰，故选择柱长为100 m的色谱柱。CP-Sil 88的固定相为100%二氰丙基-聚硅氧烷，最高温度可达到240℃；而TR-FAME极性固定相为70% 氰丙基聚硅亚苯基硅氧烷，与其他色谱柱相比，能耐受更高的操作温度，最高温度可达到260℃，且流失低，适用于 GC-MS分析脂肪酸甲酯，包括顺式和反式异构体。所以本研究选用TR-FAME(100 m×0.25 mm×0.2 μm)色谱柱进行分析。

2.2.2升温程序的优化

选择合适的柱温是实现各种脂肪酸良好分离的关键[6]。因为54种脂肪酸的相对分子质量、熔点和沸点分布范围较广，所以很难用简单的升温程序得到最佳分离效果。在确保54种脂肪酸具有很好的分离度的前提下，通过不断调节色谱柱的升温程序，发现多阶升温程序对54种脂肪酸有很好的分离效果。最终确定的升温程序为：80℃保持2 min，以30℃/min 速率升温至140℃，保持1 min；以2℃/min速率升温至240℃，保持5 min；离子源温度：220℃；接口温度：250℃；溶剂延迟：5.5 min。

2.2.3定性分析

将54种脂肪酸标准品混合，将全扫描二维谱图中各峰点质谱图导入NIST谱库进行检索而实现定性分析，对于谱图无法识别、相近的同分异构体则采用单一标准品进样的方式来进行判定。结果表明，54种脂肪酸都得到了较好的分离，在二维色谱上出现重组的现象(见表1、图4)。考虑到脂肪酸同分异构体的响应值相近，可用面积归一化法测定各脂肪酸的相对含量。

表1 54种脂肪酸的保留时间、分子量、定量离子和定性离子

图4 54种脂肪酸甲酯的质谱图

2.3 山茶油脂肪酸组成的测定

山茶油中脂肪酸的定性是采取标准品的保留时间并结合质谱进行的。山茶油中脂肪酸甲酯化合物名称及含量见表2，其图谱见图5。

1.十四烷酸甲酯；2.十六烷酸甲酯；3.(Z)-9-十六烯酸甲酯(棕榈油酸甲酯)；4.硬脂酸甲酯；5.(Z)-9-十八烯酸甲酯；6.(Z,Z)-9,12-十八烯二烯酸甲酯；7.亚麻酸甲酯；8.二十烷酸甲酯；9.11-二十碳烯酸甲酯；10.二十二烷酸甲酯；11.二十四烷酸甲酯

表2 山茶油中脂肪酸甲酯化合物名称及含量(n=3)

利用建立好的54种脂肪酸甲酯的GC-MS方法，按照1.3.2将山茶油样品进行甲酯化，再按照1.3.3色谱-质谱条件进行测定，利用面积归一化法计算其含量及相对标准误，结果见表2。本研究的山茶油中约含有11种脂肪酸，其中不饱和脂肪酸占81.62%，亚油酸甲酯、反-9-十八烯酸甲酯、反9,12-十八烯二烯酸甲酯的比例较高；饱和脂肪酸占18.38%，其中十六碳酸甲酯、硬脂酸甲酯、二十二碳酸甲酯占的比例较高。

3 结论

我们建立了54种脂肪酸的GC-MS定性定量分析方法，实现了对食品中复杂基质中脂肪酸的检测。与传统的GC法相比，本方法能同时测定54种脂肪酸，并且解决了顺反式脂肪酸的测定，可简便、有效、快速开展大量油脂中脂肪酸的检测提供参考。