首次检测水通道蛋白-4抗体阴性视神经脊髓炎谱系疾病的临床转归☆

周静 崔春平 李蕊 王婧琪 孙晓渤 卢婷婷 王玉鸽 邱伟

血管周边星形胶质细胞的水通道蛋白-4抗体（aquaporin-4 immunoglobulin G antibodies，AQP4-IgG）在视神经脊髓炎谱系疾病（neuro myelitis optica spectrum disorder,NMOSD）中的阳性率高达75%～90%[1]。故AQP4-IgG已作为NMOSD重要诊断条件，同时发现AQP4-IgG还有助于提示炎症性脱髓鞘疾病首次临床发作后向NMOSD转化的风险[2-4]，包括孤立双侧视神经炎（optic neuritis，ON）、急性横贯性脊髓炎等。但在少数高度怀疑NMOSD患者，AQP4-IgG初始检测结果为阴性，而后期随访可能转变为阳性[5]。因此，有学者指出，AQP4-IgG阳性率可能受诸多因素影响，部分血清阴性患者的抗体滴度可能低于目前可用的检测阈值，即出现“假阴性”结果[6-8]。近期报告，部分AQP4-IgG阴性的NMOSD患者[1,9]，存在抗髓鞘少突胶质细胞糖蛋白 (myelin oligodendrocyte glycoprotein,MOG)抗体[10]，或其他可能致病性抗体[9,11-12]。既往国外研究主要集中在单次检测血清AQP4-IgG阴性NMOSD患者的预后和复发分析[13-15]，缺乏血清AQP4-IgG动态变化及临床转归的前瞻性报告。本研究旨在建立一组首测血清AQP4-IgG阴性的NMOSD的临床数据，动态记录不同时间节点AQP4-IgG转换结果及患者的诊断与临床转归。

1 对象与方法

1.1 研究对象对中山大学附属第三医院神经科15例首次血清AQP4-IgG检测阴性的NMOSD患者，包括孤立双侧视神经炎、脊髓炎等患者进行前瞻性随访研究（2012年 11月至 2018年 4月）。AQP4-IgG阴性NMOSD入组标准如下：①在1次或多次临床发作中，至少2项核心临床特征并满足下列全部条件：至少l项临床核心特征为复发性ON，急性脊髓炎或延髓最后区 (area postrema syndrome，AP)综合征；空间多发；MRI表现符合临床症状；②血清AQP4-IgG检测采用细胞转染免疫荧光法（cell based assay,CBA）；③排除其他诊断。核心临床症状:①复发性ON；②急性脊髓炎（acute transverse myelitis,ATM）；③AP 综合症；④其他脑干综合征；⑤症状性发作性睡病、间脑综合征、脑MRI有NMOSD特征性间脑病变；⑥大脑综合征伴有NMOSD特征性大脑病变。排除标准；①首次检测AQP4-IgG阳性；②急性播散性脑脊髓炎、中枢神经系统（central nervous system,CNS）感染、CNS代谢性疾病、CNS血管炎等。临床复发定义为：①在病情稳定1个月以上突发神经功能恶化；②脑或脊髓MRI增强中发现新病灶。两个独立的神经病学专家对所有患者按上述的标准进行诊断[5,16-17]。本研究经伦理委员会批准，所有患者均获得知情同意。

1.2 研究方法前瞻性随访，收集患者临床资料，包括年龄、性别、脱髓鞘事件数、每次复发的临床特征、实验室及影像结果、治疗用药等。

1.3 血清AQP4-IgG检测由两位独立的研究人员通过CBA法对商业生物芯片试剂盒（Euroimmun，Germany）的抗AQP4转染细胞系进行了盲法诊断[18]。在随访过程中，采用同样检测方法，由中山大学附属第三医院神经科实验室进行重复检测。抗体滴度1:10或更高定义为AQP4-IgG阳性。实验步骤简述如下：血清（1:10）在磷酸盐缓冲盐水(Phosphate-buffered saline,PBS）中稀释。稀释后的样品在室温下与生物芯片载玻片上的AQP4转染细胞反应30 min。然后用PBS冲洗两次载玻片，再用荧光素结合山羊抗人IgG孵育30 min，最后用PBS冲洗载玻片，用显微镜测量荧光。稀释度为1:10时呈阴性的血清在1:4、1:32和1:120时检测。通过对AQP4转染细胞表面和细胞质的染色，证实了阳性反应，但在同一样本中，未转染细胞没有染色。将阳性样品滴定至1:1000（血清），以确定产生阳性结果的最高稀释度。对阴性样品，采用非稀释法再次记录检测结果。

1.4 统计学方法所有统计分析均采用SPSS 16.0进行分析。分类数据用百分比表示，实验室检测数据用稀释比表示。

2 结果

2.1 首次检测AQP4-IgG阴性NMOSD人口统计学与临床特征首次检测AQP4-IgG阴性NMOSD组人口统计学和临床特征见表1。女性11例，男性4例。平均随访时间67（19～176）个月。发病年龄 37（16～65）岁。第一次发作单纯 AP3例；ON5例；同时AP和ATM4例；同时ON和ATM3例；可见ON症状起病最多见（8例）。

血清学检测风湿免疫抗体，4例抗核抗体或抗SSA抗体阳性。脑脊液检测白细胞异常3例，蛋白增高3例，脑脊液寡克隆带弱阳性1例。脑及脊髓MRI表现：视神经异常2例，延髓异常8例，脊髓异常12例（主要分布于颈、胸髓）。

15例患者均行血清MOG-IgG检测，其中1例阳性 （病例1），该患者为47岁，女性，符合AQP4-IgG阴性的NMOSD诊断标准；发病20个月后，MOG-IgG复查转为阴性。该患者合并抗核抗体阳性（滴度1:100）。

2.2 AQP4-IgG动态演变、复发与治疗情况15例首次AQP4阴性NMOSD患者中，4例（27%）随访中 AQP4-IgG 阴性转为阳性 （病例 1、2、8、15），其中病例1在阴性和阳性之间波动，病例2持续阳性，病例 8及 15又转为阴性；2例（病例 5、10）采用血清非稀释的CBA法检测，发现滴度为极低阳性（滴度1:1）；剩余9例（60%）患者在随访中持续检测均为阴性。在动态监测AQP4-IgG至少3次以上的10例患者中，第二次检测为阴性者后面复查均为阴性（病例 3、6、9、12、13、14），第二次为阳性或血清不稀释极低阳性者，后面复查均检测过阳性（病例 1、2、8、15）。

随访观察，6例（40%）出现1至2次临床复发（病例 1、2、8、10、11、15）。在上述 4 例 AQP4-IgG阴性转阳性患者中，3例（病例 1、2、15）在阴性转变为阳性的时间节点无临床复发，1例在时间节点出现复发（病例8）；同时，9例持续阴性患者中，1例（病例11）出现临床复发。

后续随访，患者诊断修正为AQP4-IgG阳性NMOSD （4 例），MS （1 例）， 持续阴性 NMOSD（6例），ATM（3 例），ON（1例）。12例患者接受免疫抑制剂治疗，包括硫唑嘌呤（9例）、霉酚酸酯治疗（4例）、利妥昔单抗（2 例）。

表1 15例首次检测血清AQP4-IgG阴性NMOSD患者的临床特征

3 讨论

AQP4-IgG血清学阴性的NMOSD患者临床存在较大异质性。血清学AQP4-IgG阴性的NMOSD和其他未分类的AM-IDD的精确诊断和治疗目前仍然具有挑战性。我们研究表明，随着疾病病程的演变，患者血清AQP4-IgG可以在阴性和阳性之间转换，最终导致疾病诊断及临床转归改变。既往研究表明，NMOSD患者血清AQP4-IgG水平与疾病活动程度相关，抗体阳性患者比阴性患者更容易复发[19-20]。WEINSTOCK 等[20]提出，活动期患者血清AQP4-IgG阳性，而稳定或长期免疫抑制剂治疗患者血清AQP4-IgG阴性。因此，血清AQP4-IgG的检测可作为临床观察疾病活动或疗效监测的生物标记物。然而，在我们随访的15例AQP-IgG阴性患者中，部分患者AQP4-IgG从阴性转变为阳性的时间节点却无临床复发，同时检测阴性患者也可出现临床复发。因此，抗体是否呈阳性并不一定与疾病复发直接相关。在临床实践中，血清AQP4-IgG阳性不能作为预测NMOSD复发的唯一指标。CHANSON等[21]报告，血清AQP4-IgG滴度的显著升高与疾病损伤程度的恢复和恶化无关[21]。

既往研究表明，使用硫唑嘌呤、环磷酰胺和利妥昔单抗等免疫抑制剂后，NMOSD患者的AQP4-IgG水平显著降低[5,22-23]。在本研究中随访，并未观察到AQP4-IgG水平与免疫抑制剂治疗之间的相关性。如病例8，利妥昔单抗治疗过程中，AQP4-IgG由阴性转为阳性；病例15，使用吗替麦考酚酯治疗后病情稳定，而复检AQP4-IgG转为阳性。不过由于本研究样本较少，AQP4-IgG血清水平与免疫抑制剂使用的相关结果尚需进一步论证。临床研究中，ON可以转换成MS或NMOSD[24]。西方人群中80%的复发性ON患者AQP4-IgG抗体阴性，本研究中一例血清AQP4-IgG阴性的复发性ON患者在随访中转为阳性。因此，复发性ON患者仍需注意定期检测AQP4-IgG，因为抗体检测的结果可能影响疾病的诊断、治疗及预后。

有报告AQP4-IgG阴性的NMOSD患者合并MOG抗体阳性较高[10,14]，本研究资料也证实AQP4-IgG阴性组发现一例MOG抗体阳性者，但因本研究样本量较少，还需进一步论证。

本研究中，两位独立研究者在同一实验室使用同一测试方法对患者进行测试，排除了因检测方法不同导致结果的差异。在未来的研究中，应该多中心、收集更大样本，进行前瞻性、随机对照随访研究。

综上所述，AQP4-IgG阴性NMOSD患者最常出现ON；动态监测AQP4-IgG，至少2次及以上非常有必要；临床随访中AQP4-IgG可能阴性转为阳性，患者最终诊断及转归不同。