视神经脊髓炎谱系疾病外周血IgH-CDR3免疫组库多样性及其与疾病的相关性☆

钟洪坤 吴萱 张黎洁 张先兴 黄颖 陈炜 林艾羽

视神经脊髓炎谱系疾病 (neuromyelitis optica spectrum disorders，NMOSD)，目前普遍认为是一种主要由体液免疫介导的以视神经和脊髓受累为主的急性或亚急性中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病[1-2]。免疫组库（immune repertoire，IR）是指个体在任何指定时间，其循环系统中所有免疫细胞多样性的总和[3]，可有效地反映机体整体的免疫能力[4-5]。我们使用新一代高通量测序技术和多重PCR技术，扩增NMOSD患者外周血B淋巴细胞受体 （B cell receptor，BCR） 最具多样性的 CDR3区域，获得其IgH-CDR3的免疫组库信息，并结合其临床资料进行分析，旨在更深入地揭示NMOSD的免疫应答机制，以期为临床特异性免疫治疗提供新的分子靶点和理论基础。

1 对象与方法

1.1 研究对象收集2015年5月至2017年12月在我院住院或门诊确诊的女性NMOSD患者6例，年龄31～47岁，入组的患者符合2015年国际成人NMOSD诊断标准[6]。研究对象在治疗早期及稳定期分别留取双份外周血标本，研究对象AQP4抗体均为阳性，在发病1个月内接受规范治疗，随访时间8个月以上且随访期间无妊娠；并排除其他类型的炎症性脱髓鞘疾病、免疫缺陷病；无长期使用免疫抑制药物，近期无合并感染。选取性别、年龄相匹配的健康女性志愿者6例作为正常对照组。

入组患者由神经内科医师进行病史询问和查体，完善相关辅助检查，并搜集的基本临床资料包括：基本信息、首次发病时间、具体起病情况、临床表现及病情演变过程、诊治经过、常规化验检查(血常规、尿常规、粪常规、肝肾功能、抗核抗体谱、抗中性粒细胞抗体、血管炎五项、甲状腺功能等)、颅脑和(或)脊髓的磁共振图像、血清AQP4抗体情况、EDSS评分、B细胞亚群及治疗方案。

1.2 研究方法研究对象均在清晨空腹采集静脉血2 mL，所有血液标本均在采集后静置15 min，置于离心管中，存于-80℃冰箱中待测，待标本收集结束后统一送往武汉华大基因公司进行检测。

华大基因公司使用多重PCR技术对样品进行扩增，并运用Hiseq4000平台对扩增的样品进行免疫组库测序，使用过滤软件SOAPnuke进行过滤，使用免疫组库比对软件MiXCR进行序列比对，比对库为软件自带基因库。最终得到的结果包括CDR3长度分布，V/J基因使用频率，V/J组合频率，测序饱和度曲线，克隆频率分布，多样性指数，多样品共有克隆，层次聚类，MDS聚类等。

1.3 统计学方法应用SPSS 22.0进行统计学分析，实验数据用±s表示，两组间均数比较用Mann-Whitney U检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 建立NMOSD患者外周血B细胞IgH-CDR3免疫组库在本研究中，运用了Hiseq 4000平台，对送检的样品进行了免疫组库测序，得到6例NMOSD患者治疗早期和稳定期及6个健康志愿者的外周血IgH-CDR3的免疫组库信息（表1）。

2.1.1 CDR3总数、种类分析 治疗早期及稳定期NMOSD患者组外周血IgH-CDR3的总数及种类相较于正常对照组均有所下降。NMOSD患者治疗早期组外周血B细胞 IgH-CDR3总数为 3.26×106，稳定期组的为3.29106，均低于正常对照组的3.49×106，但差异无统计学意义；NMOSD患者治疗早期组外周血B细胞 IgH-CDR3种类为 1.46×104，稳定期组的为 1.3×104，均低于正常对照组的1.56×104，但差异无统计学意义。

2.1.2 CDR3长度统计分析 NMOSD患者组外周血B细胞IgH-CDR3氨基酸序列长度的分布情况近似正态分布，这与正常对照组的结果是相一致的，但氨基酸序列长度分布情况在一定范围内与正常对照组存在差异。NMOSD患者组IgH-CDR3区域氨基酸序列长度在12-14aa及16-18aa范围内的使用频率较正常对照组高；氨基酸序列长度在21-29aa范围内的使用频率较正常对照组低（图 1）。

表1 研究标本免疫组库基本信息

2.2 V、J基因使用频率分析NMOSD患者外周血B细胞受体V基因使用频率最高的为IGHV3-7，且NMOSD患者组偏好使用IGH-V1族及IGHV3族基因，这与正常对照组无差异。NMOSD患者组V基因的等位基因使用频率和健康对照组之间存在一定差异，其中等位基因IGHV1-69、IGHV3-23的使用频率在NMOSD患者组中相较于正常对照组要高，等位基因IGHV1-8、IGHV3-30的频率相较于正常对照组却要低（图2）。①NMOSD患者治疗早期组外周血B细胞IGHV3-23基因的使用频率为0.083±0.014(n=6)，高于正常对照组的0.062±0.015(n=6，P=0.065)；稳定期组的为 0.082±0.018(n=6)，高于正常对照组的 0.062±0.015(n=6，P＜0.05)；②NMOSD患者治疗早期组的外周血B细胞IGHV3-30基因的使用频率为0.078±0.026(n=6)，稳定期组的为 0.081±0.027(n=6)，均低于正常对照组的0.095±0.02(n=6)，但差异均无统计学意义（P＞0.05）。

图1 外周血B细胞IgH-CDR3氨基酸序列长度分布

治疗早期及稳定期NMOSD患者组B细胞IGHJ1、IGHJ2、IGHJ3、IGHJ4 亚基因的使用频率较正常对照组均有所增加，相反IGHJ5、IGHJ6亚基因的使用频率较正常对照组均有所减少 （图3）。①治疗早期组的NMOSD患者外周血B细胞IGHJ3基因的使用频率为0.072±0.013(n=6)，高于正常对照组的 0.057±0.012(n=6，P=0.065)；稳定期组的为 0.077±0.02(n=6)，高于正常对照组的0.057±0.012(n=6，P＜0.05)；②NMOSD 患者治疗早期组外周血B细胞IGHJ5基因的使用频率0.124±0.009(n=6)，低于正常对照组的 0.142±0.014(n=6，P＜0.05)；稳定期组的为 0.123±0.02(n=6)，低于正常对照组的 0.142±0.014(n=6，P=0.065)。

2.3 免疫组库多样性分析NMOSD患者组的外周血B细胞IgH-CDR3免疫组库多样性相较于正常对照组存在着一定的降低趋势，治疗早期NMOSD患者组的B细胞IgH-CDR3免疫组库多样性普遍高于稳定期患者。本研究采用D50这一指标，作为IgH-CDR3序列多样性的评价指标 （表 2）：①NMOSD患者治疗早期组外周血B细胞IgHCDR3序列多样性为4.08±1.21(n=6)，稳定期组的为3.13±1.35(n=6)，均低于正常对照组的4.30±0.29(n=6)，但差异无统计学意义；② NMOSD患者治疗早期组的外周血IgH-CDR3序列多样性相较于稳定期组要高 (除外患者6)，D50分别为4.42±1.04（n=5）和 2.82±1.27（n=5），但差异无统计学意义；③ NMOSD患者治疗早期(除外患者2、患者3)外周血B细胞IgH-CDR3序列多样性相较于正常对照组要低，D50 分别为 3.33±0.71（n=4）和 4.30±0.29(n=6)，差异有统计学意义（P＜0.05）；NMOSD患者稳定期组的(除外患者6)外周血B细胞IgHCDR3序列多样性也低于正常对照组，D50分别为2.82±1.42（n=5）和 4.30±0.29(n=6)，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图2 TOP20-V基因频率分布图

图3 J基因频率分布图

2.4 疾病优势取用序列的筛选及分析将NMOSD患者外周血B细胞IgH-CDR3序列库与正常对照者进行进一步比较，初步筛选出2种疾病特征性的优势取用序列“CASSICLGSGCGGYYYGMDVW”、“CARPNYYGSVRTGYGMDVW”。治疗早期NMOSD患者优势取用序列高于稳定期患者及正常对照者（表 3）；其中“CASSICLGSGCGGYYYGMDVW”这种序列在NMOSD患者治疗早期组中的克隆频次显著高于NMOSD患者稳定期组及正常对照组（图 4）。

3 讨论

尽管众多研究表明B细胞功能的紊乱在NMOSD发病及进展中起到重要作用[7]，但关于NMOSD外周血IgH-CDR3免疫组库的报告却较为少见，更加深入地了解B细胞的功能，有利于临床上对NMOSD疾病进行更高效的研究[8]。BCR的可变区包括 CDR1、CDR2、CDR3， 具有高度多样性，其中最具多样性的是IgH-CDR3，该区域在其识别抗原的过程中可起到决定性作用[9-10]。以往常用的免疫组库测序技术存在有效信息量少、影响因素多等不足之处[11-12]。本研究中将多重PCR技术与第二代高通量测序技术相结合，获得了容量巨大的NMOSD患者外周血B细胞IgH-CDR3序列的免疫组库，并通过对其免疫组库特点及临床资料进行研究，发现在疾病的不同时期，NMOSD患者外周血B细胞克隆扩增的情况存在一定程度的差异。

表2 克隆多样性指标统计表

本研究中虽可观察到6例NMOSD患者外周血B细胞IgH-CDR3总数目及CDR3种类较正常对照组有所下降，但差异无明显统计学意义，并且无论是治疗早期还是稳定期的NMOSD患者，其外周血IgH-CDR3氨基酸序列长度的分布均表现为近似正态分布，这个结果与正常对照组相一致，说明NMOSD患者外周血B细胞的IGH-CDR3的数目与种类并未出现整体性偏移。然而，值得关注的是患者2及患者3外周血IgH-CDR3总数、CDR3种类和免疫组库多样性指标D50都要明显高于其他NMOSD患者及正常对照者，这两位患者在发病后均接受1000 mg激素冲击治疗，其他患者发病后仅接受500 mg或更低剂量的激素治疗，表明这两位患者在治疗早期免疫系统反应更为活跃，推测大剂量激素冲击治疗可调动NMOSD患者的免疫系统，短时间内可显著提高患者的免疫组库多样性，这一反应可能有助于清除体内的特异性抗原。

NMOSD患者更偏好使用等位基因IGHV1-69、IGHV3-23、IGHJ1、IGHJ2、IGHJ3、IGHJ4， 而等位基因 IGHV1-8、IGHV3-30、IGHJ5、IGHJ6 的 使用频率较正常对照组降低，但是导致这些改变的具体原因尚未明确，推测可能与NMOSD患者在疾病状态下的免疫调节相关，具体机制有待进一步研究。

表3 IgH-CDR3优势取用序列表达频次表

图4 NMOSD患者各阶段和正常对照者外周血B细胞IgHCDR3优势取用序列频次 NMOSD：视神经脊髓炎谱系疾病；1：NMOSD患者治疗早期组（除外患者2）；2：NMOSD患者稳定期组（除外患者2）；3：正常对照组使用非参数检验进行差异显著性检验，其中ns表示差异不显著（P＞0.05）；*表示有统计学差异（P＜0.05）。

本研究运用免疫组库测序技术挑选出了高频表达的NMOSD患者外周血B细胞IgH-CDR3序列，即为优势取用序列，并与正常对照组进一步比较，发现了2种可能与NMOSD疾病的发病、进展高度相关的优势取用序列“CASSICLGSGCGGYYYGMDVW”、“CARPNYYGSVRTGYGMDVW”。其中氨基酸序列“CASSICLGSGCGGYYYGMDVW”在治疗早期NMOSD患者外周血B细胞IgHCDR3序列库中高度表达，累计频次达21429次，显著高于稳定期NMOSD患者及健康志愿者，提示治疗早期的NMOSD患者免疫系统正在识别与该抗体相对应的抗原，可能与NMOSD疾病的发生、进展密切相关，但具体作用及机制需要进一步的研究。此外，NMOSD患者外周血B细胞免疫组库多样性较健康志愿组降低，且治疗早期患者免疫组库多样性较稳定期患者增加；在治疗早期，经大剂量激素 （甲强龙1000 mg）冲击治疗的NMOSD患者其多样性较经其它剂量激素 （甲强龙≤500 mg）治疗的患者明显增高，说明免疫组库的多样性可在一定程度上评估NMOSD患者的疾病状态及不同治疗方案的治疗效果。已有研究表明免疫组库的多样性可以反映机体的免疫状态[13]，因此或可依据免疫组库的多样性及疾病特异性B细胞克隆扩增水平反应NMOSD的疾病进展及疾病的治疗效果，预测疾病复发及评估预后。

总之，虽然由于病例数量的限制，该研究存在一定的局限性，但病例数量若能扩大，并使上述发现在试验中得到更多证实，有期为NMOSD的诊断、治疗及疾病状态的评估提供重要的新型临床监测指标。另外，假如这些疾病特征性BCR IgHCDR3序列所对应的抗原的性质和特征可以得到更深层次的研究，必定可以为深入研究NMOSD发病及进展的免疫应答机制提供新的思路，并可期为NMOSD的免疫治疗提供重要的理论基础和新的分子靶点。