电针对多囊卵巢综合征大鼠脂肪组织代谢因子表达的研究

匡洪影，张丽，李威，张益蒴，冯文婷

(1.黑龙江中医药大学附属第一医院，哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040;3.长春科技学院，长春 130000;4.山西省太原市第三人民医院，太原 030000)

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是女性常见的代谢性疾病之一，在临床上以雄激素过高、肥胖、持续无排卵、卵巢多囊样改变为特征，常伴有体质量指数(BMI)的异常。据统计PCOS患者中发生肥胖的概率为30%～50%，且肥胖与PCOS的临床表型之间关系密切[1]。脂肪细胞能够分泌具有生物活性的瘦素、脂联素及与炎症相关的细胞因子。脂肪因子分泌异常可能是导致PCOS发生的机制之一。PCOS患者体内脂肪组织的异常蓄积可能引起脂肪因子分泌紊乱，进而可能影响患者的生殖功能的调控。研究表明，通过改善生活方式，降低体质量可以改善PCOS患者的排卵障碍[2]，提示降低 PCOS体内脂肪蓄积量及改善脂肪组织的内分泌水平可能对缓解 PCOS的临床表征有积极的作用。有研究表明，针刺可以减轻PCOS患者的体质量，改善PCOS患者的症状[3]，但针刺的机制却未明确阐明。本文拟通过观察针刺对PCOS大鼠脂肪组织代谢因子表达的影响，探索其治疗PCOS的内在可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级雌性23日龄SD大鼠35只，体质量为(50±5)g，由黑龙江中医药大学动物实验中心提供，实验动物许可证号[SCXK(黑)2013-001]。以温度 21℃～23℃，相对湿度42%～56%，照明 12 h昼夜交替环境下饲养，动物自由摄取食物和水，隔日换垫料，清理笼具。实验过程中对大鼠的操作均按照黑龙江中医药大学实验动物使用与伦理委员会标准执行，符合动物福利的基本原则、3R原则等相关的要求。

1.2 主要试剂与仪器

注射用大豆油(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，去氢表雄酮(dehydroepiandrosterone， DHEA)(北京百灵威科技有限公司)，0.9%氯化钠注射液(四川沱牌药业有限责任公司)，75%医用乙醇(德州乐康消毒制品有限公司)，华佗牌电子针疗仪(SDZ-Ⅱ型，苏州医疗用品厂有限公司)，0.30 mm×25 mm一次性针灸针(贵州安迪有限公司)，显微镜(日本 OLYMPUS BX 60)，血清 FSH检测试剂盒(武汉优尔生科技股份有限公司，CAT:CEA830Ra)，血清 LH检测试剂盒(武汉优尔生科技股份有限公司， CAT:CEA441Ra)，血清高密度脂蛋白检测试剂盒(武汉优尔生科技股份有限公司，CAT:SEB006Ra)，血清低密度脂蛋白检测试剂盒(武汉优尔生科技股份有限公司， CAT:SEB107Ra)，血清胆固醇检测试剂盒(武汉优尔生科技股份有限公司，CAT:CEB701Ge)，血清甘油三酯检测试剂盒(武汉优尔生科技股份有限公司，CAT:CEB687Ge)。

1.3 造模方法

空白组每日给予0.2 mL注射用大豆油颈背部皮下注射;模型组和针刺组均给予99.99%DHEA以6.0 mg/100 g的剂量溶于0.2 mL注射用大豆油中，颈背部皮下注射，连续注射21 d[4]。各组造模开始8 d后于每日8:00进行连续阴道涂片，经亚甲蓝染色后观察大鼠的动情周期变化[5]。注射DHEA的大鼠阴道上皮细胞持续10 d为角化状态为动情周期紊乱，造模第21 d处死预先准备的模型评估大鼠 3只(每组 1只)进行卵巢 HE染色，大鼠动情周期紊乱并且卵巢呈多囊状态表示造模成功。本实验大鼠全部造模成功。

1.4 动物分组与处理

将35只大鼠随机分为空白组9只、模型组9只、针刺组9只和空白针刺组8只。空白针刺组为研究大鼠不同部位脂肪因子mRNA的差异性表达而特设，只作为比较研究，饲养方法与空白组相同，与针刺组同等时间进行针刺干预。针刺组大鼠造模成功后开始针刺干预。取穴为关元(腹部前正中线，脐下约25 mm处)、中极(腹部前正中线，脐下约35 mm处)、子宫(中极旁开约25 mm处)和三阴交(后肢内踩尖直上10 mm处)，腧穴定位参照全国协编教材《实验针灸学》[6]中大鼠标准穴位图谱以及动物与人解剖定位。电针选择低频连续波，频率为2 Hz，强度以针刺穴位微微颤动为度[7]。每日1次，每周5 d。第1周每次15 min，第2、3周每次20 min，第4、5周每次25 min，连续5周电针刺激干预。空白组和模型组不给予任何干预，仅给予与其他组同等条件下抓取刺激。

1.5 观察指标

1.5.1 实验动物体质量变化曲线和动情周期

各组大鼠造模开始后每日 7:30观察大鼠生命体征及活动度，进行称重并记录体质量。各组大鼠造模开始8 d后于每日8:00进行连续阴道涂片，通过观察阴道脱落细胞形态的方法确定大鼠动情周期。

1.5.2 血清激素水平检测

在镜下观察空白组、针刺组阴道涂片进入动情周期的动情期后，禁食12 h后眼眶取血，将血放置1 h，3500 rpm离心15 min后分离血清，留取上清液并放置﹣70℃冰箱保存。卵泡刺激素(FSH)、黄体生成激素(LH)的测定由武汉云克隆科技股份有限公司检测中心采用酶联免疫吸附法测定，脂代谢相关高密度脂蛋白胆固醇(HLD-C)、低密度脂蛋白 (LDL)、甘油三酯(TG)、胆固醇(CH)的测定由黑龙江中医药大学附属第一医院检验科生化组采用酶联免疫吸附法测定，具体操作步骤均按照试剂盒说明书进行。具体操作步骤为，加样(标准品及样本)50 μL后，立即加入检测溶液 A50 μL，37℃孵育 1 h;甩干，洗板 3次;加检测溶液 B100 μL，37℃孵育30 min;洗板5次后加TMB底物90 μL，37℃孵育10～20 min;最后加终止液50 μL，立即450 nm读数。

1.5.3 脂肪组织的取材保存和卵巢组织HE染色

针刺组处死前针刺1 h，各组大鼠分离血清后用颈椎脱臼法处死大鼠。取腹股沟脂肪、腹部皮下脂肪、腹部脂肪、子宫旁脂肪、性腺旁脂肪、肠系膜脂肪，称量各个组织重量后保存于﹣70℃冰箱以备后续实验使用;取大鼠一侧卵巢用 10%中性福尔马林固定，经石蜡包埋并切片后，使用苏木素-伊红染色液对切片进行HE染色。在显微镜镜下观察卵巢切片形态变化，并留取图片。

1.5.4 实时荧光定量PCR检测

实时荧光定量PCR法检测各组大鼠不同部位脂肪瘦素(leptin)、脂联素(adiponectin)、孤儿核受体Nr4a2(Nr4a2)、孤儿核受体Nr4a3(Nr4a3)的表达。根据试剂盒说明书[thermo scientific BR green qpcr master mix(2x) ROX solution]要求进行操作，提取组织总RNA，将其逆转录为cDNA后进行聚合酶链式反应，反应体系为25 mL，分别加入10×PCR Buffer 2.5 μL、dNTP(2.5 mM) 2 μL、Mg2+1.5 μL、上游引物(50 mM)0.5 μL、下游引物(50 mM) 0.5 μL、cDNA 0.5 μL、Taq酶0.5 μL、DEPC水17 μL。反应温度为，预变性，95℃ 5 min;变性，95℃ 30 s;60℃退火;延伸，72℃，30 s;重复变性、退火、延伸，共35个循环，充分延伸，72℃，10 min，结束温度为 4℃。所得 CT 值，采用 2﹣ΔΔCT法进行计算。参照NCBI基因库的基因序列来设计引物，该实验扩增片段长度为100～300 bp。具体如下。

表1 引物序列

为明确电针对模型动物的疗效作用，空白针刺组大鼠与针刺组大鼠同时接受相同剂量及频率的电针刺激。在电针刺激结束后检测各部位脂肪组织细胞因子mRNA的表达水平，分别计算正常大鼠及模型大鼠各部位脂肪因子在接受针刺动物及未接受针刺动物中表达水平的比率变化，采用 R软件对基因表达水平进行heatmap分析。

1.6 统计学方法

采用SPSS19.0软件进行数据处理。检验数据正态性后用单因素方差分析(One-way ANOVA)法比较，方差齐者用Bonferroni(B)检验，方差不齐者用Dunnett's T3(3)检验。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PCOS模型动物鉴定及电针的疗效评估

由图1A可见，3组大鼠在实验期间的体质量变化差异无统计学意义(P＞0.05)。由图1B可见，模型组相比空白组动情周期时间明显延长(P＜0.05);针刺组与模型组比较，动情周期时间缩短(P＜0.05)。由图 1C可见，空白组卵巢HE染色可见各个时期的卵泡且形状规则，部分卵泡可见增大的卵泡腔和呈丘状突出于卵泡腔的卵丘，紧密排列的颗粒细胞可达 8～9层，排卵后的黄体黄素化明显，间质与卵泡内膜界限相对于模型组来说较为清晰，以上均提示空白组大鼠有规律排卵。模型组可见大小不等的未成熟卵泡，囊状卵泡多且形状不规则，部分卵泡可见退行性闭锁，颗粒细胞层数减少至2～3层，黄体少见，且组织间界限不是很清晰。针刺组可见单个成熟卵泡，颗粒细胞层数较模型组多，3～5层，组织界限较模型组清晰。

2.2 实验动物体质量及不同部位脂肪组织重量差异

由图2A可见，针刺组与空白组、模型组比较，体质量明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。由图 2B可见，针刺组腹股沟脂肪、腹部皮下、子宫旁、性腺旁、肠系膜脂肪湿重较空白组明显减轻，差异有统计学意义(P＜0.05)，模型组腹股沟脂肪湿重较针刺组明显减轻，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.3 各组大鼠血脂、血清性激素水平变化

由图3A可见，模型组HLD-C、TG、CH、LDL较空白组、针刺组明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。由图3B可见，针刺组血清FSH较空白组明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。由图3C可见，模型组LH/FSH比值较空白组升高，针刺组较模型组下降，但差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.4 不同组别不同部位脂肪因子mRNA表达水平

由图4可见，与空白组比较，模型组的脂联素mRNA在肠系膜脂肪，Nr4a2 mRNA在性腺旁、肠系膜脂肪表达明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，Nr4a2 mRNA在子宫旁脂肪，Nr4a3 mRNA在腹部皮下脂肪、腹部脂肪表达明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。与模型组比较，针刺组的瘦素 mRNA在肠系膜脂肪、Nr4a2和Nr4a3 mRNA在子宫旁脂肪表达均明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，脂联素 mRNA在腹部脂肪表达明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。

图1 DHEA对大鼠卵巢机能的影响及电针的作用评估(HE染色，×100)

图2 实验动物体质量及不同部位脂肪重量统计

图3 大鼠血脂及血清性激素水平比较

图4 不同组别不同部位脂肪因子的表达水平比较

2.5 各组不同部位脂肪因子针刺前后表达水平比率

由图5可见，不同脂肪因子在空白针刺组/空白组和针刺组/模型组大鼠不同部位表达水平不同，左侧 4组(红色)为正常大鼠针刺后不同部位脂肪组织因子表达的变化，右侧4组(绿色)为PCOS模型大鼠针刺后不同部位脂肪组织因子表达的差异，针刺改变了模型组大鼠不同部位脂肪因子的表达水平，PCOS模型大鼠针刺后全身脂肪因子的变化模式与正常大鼠接受针刺后脂肪因子的变化模式相比存在明显的差异。

图5 各组不同部位脂肪因子针刺后表达水平比率热图

3 讨论

多囊卵巢综合征是育龄期女性常见的疾病，发病率逐年升高，PCOS患者多伴有肥胖的发生，PCOS症状与体质量指数的增加密切相关[1]。针刺是中医治疗中常用的能够减轻肥胖患者的体质量的有效治疗方式，同时针刺也对PCOS患者的临床症状有治疗作用。有研究表明，针刺对肥胖患者的血脂水平，胰岛素抵抗程度，脂肪累积程度均能起到改善作用[8-9]。

脂代谢异常可能是 PCOS患者体内最常见的代谢紊乱，主要表现为TG、LDL的升高及HDL的降低[10]。相关实验表明，PCOS大鼠HDL、LDL、TG、CH均升高，针刺后均下降，这可能与体内脂肪组织异常分泌脂肪因子，内脏脂肪的异位沉积等有关;针刺可能抑制食欲，改善胰岛素抵抗，加快脂肪的分解和能量的代谢[11]，达到改善 PCOS症状的作用。研究表明，PCOS患者的 LH分泌增加、FSH分泌减少，与体内胰岛素共同作用合成雄激素，使胰岛素分泌增加，形成恶性循环，从而加重PCOS病情[12]。实验结果表明针刺可能通过改善 PCOS整体情况而调节FSH和LH的分泌。

脂肪组织分泌的脂肪细胞因子过多可引起糖脂代谢紊乱和PCOS，从而导致不孕[13]。有研究表明，在PCOS患者中肥胖与胰岛素抵抗可能相互促进，加重PCOS症状[14]。大约80%的PCOS妇女和95%的肥胖妇女检测到胰岛素抵抗，高胰岛素血症和胰岛素抵抗可能与瘦素、脂联素有关[15]。瘦素受体在颗粒细胞中的表达与糖皮质激素协同作用促进类固醇生成，瘦素通过负反馈调节下丘脑受体葡萄糖介导的胰岛素分泌[16]。脂联素的主要作用在于胰岛素的上调和能量平衡，可以增强胰岛素分泌，抑制肝细胞的糖异生[17]。高胰岛素血症可能通过引起颗粒细胞过早成熟，抑制颗粒细胞增殖和 LH水平升高的发展而导致无排卵[18]。瘦素在高瘦素血症等条件下的负面影响是抑制卵巢对促性腺激素刺激的反应，可能在PCOS的发展中起作用[19]。更有研究表明瘦素抑制卵泡，影响胚胎植入和子宫内膜容受，从而影响生殖功能[20]。脂联素已被证明在体外可抑制雄激素的产生和卵泡细胞的LH受体基因的表达[21]。脂联素可能在卵母细胞成熟，颗粒细胞增殖和死亡以及雌二醇和孕酮的产生中发挥作用[22]。Nr4a受体在糖脂代谢中起到重要作用。在禁食和胰高血糖素刺激下或糖尿病出现病理性糖异生时，肝脏的Nr4a受体增加[23]。在肌肉细胞中敲降Nr4a3基因，发现调节脂肪酸氧化、丙酮酸使用的基因显著衰减，氧化代谢减慢[24]。Nr4a3可以促进脂肪细胞胰岛素刺激的葡萄糖摄取，增强胰岛素信号，研究发现Nr4a受体的过量表达显著加快脂肪细胞的分解[25]。肥胖型PCOS患者发生不孕几率显著高于正常人群，其病理机制可能与上述脂肪因子的表达水平异常有关。针刺可以减轻体质量，改善 PCOS症状，因此推测对 PCOS患者的针刺治疗可能改善患者不孕的情况。

脂肪作为全身最大的内分泌器官，在调节机体代谢、生殖、心血管功能和免疫方面通过分泌脂肪细胞因子和蛋白质因子以自分泌、旁分泌和内分泌的模式发挥作用。肥胖者下丘脑瘦素受体对瘦素的敏感性下降，负反馈导致瘦素分泌增加，产生瘦素抵抗，使瘦素对胰岛素的负反馈调节机制受到破坏，进而诱发胰岛素抵抗[26]。有研究表明PCOS大鼠脂联素水平明显降低，瘦素水平明显升高，与机体的胰岛素抵抗状态相符[27]。本研究通过瘦素在3组大鼠不同部位脂肪因子表达水平的研究，发现瘦素在PCOS大鼠不同部位变化趋势不一致且变化不明显，但电针可以明显升高瘦素在肠系膜脂肪上的表达。脂联素是脂肪组织与机体代谢的纽带，与体脂含量呈负相关。功能主要有刺激脂肪代谢、抑制脂肪合成，促进胰岛β细胞分泌胰岛素[28]。研究表明，脂联素水平在PCOS患者较正常者低[29]。Artimani T等[30]研究表明 PCOS女性卵巢颗粒细胞中脂联素和受体减少，并且卵巢过度刺激后高分子量脂联素也减少。脂肪组织增多导致脂联素基因表达降低，导致脂代谢紊乱，增加胰岛素抵抗的发生风险，加重PCOS症状[31]。本实验结果表明针刺前脂联素 mRNA的表达水平在PCOS大鼠肠系膜脂肪中明显降低，电针刺激后明显降低了其在腹部脂肪的表达，由此推测PCOS的症状可能主要与脂联素在肠系膜脂肪表达水平的降低有明显关系，而与其他部位脂联素表达的关系不显著。有研究揭示了一系列由 Nr4a亚家族成员的功能，包括一般代谢、免疫、细胞应激、记忆、胰岛素敏感性和心脏稳态，通过调节其产物参与这些过程的特定靶基因。这些受体在各种疾病如癌症、炎症、动脉粥样硬化和肥胖症的发病和进展中起作用[32]。本实验结果表明，电针治疗PCOS大鼠后Nr4a2和Nr4a3 mRNA在子宫旁脂肪的表达明显上升。因此可以推测电针刺激后Nr4a亚家族成员在子宫旁脂肪对糖脂的摄取利用明显增加，脂肪因子Nr4a2和Nr4a3可能主要通过旁分泌作用来改变局部糖脂代谢并改善症状。

尽管针刺已经是国际认可的一种治疗疾病的有效手段，但有关针刺科学性的争论却一直没有停止[33]。如果针刺仅仅是一种简单的物理刺激，那么正常大鼠及PCOS模型大鼠在获得针刺刺激后，不同部位脂肪组织关键因子表达的变化趋势应该相同或相近。通过热图可以明显看出，空白针刺组/空白组和针刺组/模型组大鼠不同部位不同因子表达水平明显不同而且同一因子在同一部位正常和 PCOS状态下对电针治疗的表达不同。这些结果表明针刺不是单纯的物理刺激而是一种有潜在治疗机制的有效疗法。电针对PCOS模型动物异常表型的疗效机制可能涉及体内多种因子表达和信号通路传导的改变。

通过热图发现同一个因子在接受针刺后的表达趋势和变化程度并不完全一致，同一部位脂肪组织在接受针刺后脂肪因子的表达量和变化水平也是不同的，针刺后的反应性与因子的表达程度有差异。这可能与针刺作用靶点不同、与脂肪组织的类型不同有关，不同部位的脂肪组织对于针刺的反应性存在差异。这说明了针刺的作用靶点可能是某一部位脂肪的某个因子，针刺对于全身机能调节的机制并不是说所有脂肪组织当中变化趋势都一致，而是存在着部位的差异性，在今后还要继续对针刺的作用机制进行研究。

综上所述，针刺调节PCOS模型大鼠脂肪的机制主要是通过肠系膜脂肪的瘦素、腹部脂肪的脂联素和子宫旁脂肪的Nr4a2、Nr4a3发挥作用，针刺后脂肪因子在全身不同部位脂肪的表达水平有差异性，脂肪作为一个内分泌器官通过瘦素和脂联素影响 PCOS患者的生殖情况。