利用UHPLC-ESI-MS/MS法测定川陈皮与其混伪品中的黄酮类成分

李峰庆，王 福,，杨放晴，陈仕伟，熊素琴，陈鸿平，刘友平*，李小川*

1成都中医药大学药学院 中药标准化教育部重点实验室，成都 611137；2南充市食品药品检验所，南充637000

芸香科植物橘(CitrusreticulataBlanco)及其栽培变种的成熟干燥果皮为中药橘皮，又称陈皮，始载于《神农本草经》，有理气健脾、燥湿化痰之效[1]，是历代医家常用的一味理气药，在临床与成药生产中都有较广泛的使用。我国柑橘分布广泛，变种甚多，故认为凡源于芸香科植物橘及其栽培变种的成熟果皮都能做陈皮入药，但随着柑橘育种技术的发展和实践，柑橘新品种的推出逐渐打破了原有的品种分布格局。如以四川“大红袍”为代表的道地药材来源植物，其栽培面积逐渐被不知火柑橘等新品种所超越或取代[2-3]，道地药材川陈皮也随之减少，药材市场川陈皮常见混伪品多见宽皮柑橘类植物的果皮[4](以不知火橘皮及其早晚熟变种为主)，因此，有效区分川陈皮与常见混伪品对保证川陈皮品质、临床疗效以及资源保护具有重要意义。

不同栽培品种来源陈皮药材的区分一直较为困难，尤其混伪品切丝后与正品药材真伪难分。本课题尝试采用DNA条形码技术区分正品陈皮与其混伪品，结果表明条形码通用序列ITS2序列不能较好地区分[5]。液相色谱或其联用质谱技术为常见文献报道中药材化学成分分析的方法，但色谱分析法依赖标准品，对中药材中含量较低的化学成分难以检测，定量分析化学种类有限，难以反映其化学成分的代谢谱[6]。近年来，随着基于UHPLC-ESI-MS/MS技术的代谢组学的发展，为中药材化学成分的全面分析提供了一种可靠的方法。Qin等[7]提出了基于植物代谢组学技术的中药材质量评控思路，认为代谢组学技术可以用于中药的区分或差异性评价。黄酮类成分为陈皮中主要起抗氧化、抗肿瘤、抗炎、心血管保护、神经保护等活性的一大类有效成分，又细分为以川陈皮素为代表的多甲氧基黄酮类及以橙皮苷为主的二氢黄酮苷类，本课题组前期研究陈皮“陈久者良”产生机制就是以多甲氧基黄酮为主要指标成分。

因此，本文以道地药材川陈皮及其常见混伪品不知火橘皮为研究对象，利用UHPLC-ESI-MS/MS法测定陈皮有效成分黄酮类成分。首先基于多渠道公共质谱数据库对黄酮类化合物进行定性鉴定分析，明确川陈皮与其混伪品的黄酮类成分代谢谱；其次采用PCA与OPLS-DA分析法对其黄酮代谢物进行分类，探寻基于代谢物类别差异进行鉴别的方法；然后通过火山图分析明确差异化合物上调下调，经过KEGG分析得知黄酮类化合物的代谢通路差异；最后利用基于差异化合物类别及相对含量寻找川陈皮与其混伪品特征性成分与标志物。其研究结果将建立一种高效区别川陈皮与其混伪品的方法，并为柑橘其他品种的区分与鉴定提供参考。

1 材料

超高效液相色谱-质谱联用仪(Ultra High Performance Liquid Chromatography，UHPLC，Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A，Tandem mass spectrometry，MS/MS，Applied Biosystems 6500 QTRAP)；色谱柱(Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18:1.8 μm，2.1mm×100mm)；ME04E电子分析天平(捷久计量衡器(上海)有限公司)；多样品组织研磨仪 CEBO-24(上海测博)；SC-3610低速离心机(安徽中科中佳科协仪器有限公司)；移液枪(德国Eppendorf公司)。乙腈(美国Fisher chemical，色谱纯)；哇哈哈纯净水；甲酸(美国，MREDA Technology Inc)；甲醇、乙醇(北京化工厂，分析纯)。

实验所用样品采集于四川省南充市营山县青山村等地，采集时间为2018年12月7号，采集柑橘成熟果实后，现场剥皮，返回实验室晾干，编号标记后，保存于-80 ℃冰箱。新鲜样品由成都中医药大学严铸云教授鉴定，分别为芸香科植物橘C.reticulata‘Dahongpao’与C.reticulata‘Buzhihuo’的果皮。样品信息如下表1。

表1 样品信息

2 实验方法

2.1 样品制备

将样品置于真空冷冻机干燥，取0.5 g利用研磨仪(Retsch)研磨(30 Hz，1.5 min)至粉状，称取100 mg的粉末，与1.0 mL 70%的甲醇水溶液混合均匀，置于4 ℃的冰箱过夜，期间3次涡旋，提高提取率，离心(转速10 000 rpm，10 min)后，吸取上清，用0.22 μm微孔滤膜过滤样品，并保存于进样瓶中，用于UHPLC-ESI-MS/MS分析。

2.2 色谱与质谱条件

色谱条件：以0.04%乙酸水(A)-0.04%乙酸乙腈(B)为流动相，梯度洗脱(0～11.0 min，95%→5%A；11.0～12.0 min，5%A；12.0～12.1 min，5%→95%A；12.1～15.0 min，95%A)；流速0.4 mL/min；柱温40 ℃；进样量2 μL。

质谱参数：电喷雾离子源温度500 ℃，质谱电压5 500 V，帘气压25 psi，碰撞诱导电离设置参数“高”，去簇电压与碰撞能的设置参考文献[8]。

2.3 代谢物定性定量及数据分析

基于代谢物信息公共数据库对质谱检测的一级谱、二级谱数据进行定性分析。其中部分物质定性，分析时去除了同位素信号，含钾离子、钠离子、氨基离子的重复信号，以及本身是其他更大分子量物质的碎片离子的重复信号。代谢物结构解析参考MassBank、KNSPSAcK、HMDB、MoToDB、METLIN等已有的公共数据库[9-10]。获得不同样本的代谢物质谱分析数据后，用MultiaQuant软件对所有物质质谱峰进行峰面积积分，并对其中同一代谢物在不同样本中的质谱出峰进行积分校正[11]。如图1为随机抽取的代谢物在不同样本中的定量分析积分校正结果，横坐标为代谢物检测的保留时间(min)，纵坐标为某代谢物离子检测的离子流强度(cps)。

图1 代谢物积分校正图Fig.1 Metabolite integral correction chart

2.4 样本质控分析

质控样本(QC)由样本提取物混合制备而成，用于分析样本在相同的处理方法下的重复性。在仪器分析的过程中，每10个检测分析样本中插入一个质控样本，以监测分析过程中的重复性。通过对不同质控样本质谱检测分析的总离子流图(图2)进行重叠展示分析，可以判断代谢物提取和检测的重复性，即技术重复。仪器的高稳定性为数据的重复性和可靠性提供了保障。

图2 QC样本质谱检测TIC重叠图Fig.2 TIC overlapping map detected by QC sample mass spectrometry

3 结果与分析

3.1 黄酮类化合物的鉴定结果

经过分析本文共鉴定出228种黄酮类化合物，包括多酚12种、花青素21种、黄酮类132种、黄酮醇36种、黄烷酮20种、异黄酮7种，其中川陈皮中鉴定出特有化合物15种(表3)，混伪品中鉴定出特有化合物16种(表4)，具有明显药理活性的化合物组合可以明显作为区分二者的标志化合物。

表4 混伪品中特有的黄酮类化合物

续表4(Continued Tab.4)

3.2 主成分分析(PCA)与正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)结果

主成分分析是一种将变量重新组合成一组新的相互无关的几个综合变量[12]，同时根据实际需要从中可以取出几个较少的总和变量尽可能多地反映原来变量的信息的方法。本文通过该分析方法将黄酮类化合物的差异通过降维处理以直观反映样本之间的代谢物差异情况。图3a中可以看出，主成分PC1与PC2的占比分别达到了63.10%和20.77%，积累贡献率达到了83.87%。川陈皮与其混伪品分别聚为一类，证实了实验的可靠性与重复性。

正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)被广泛用于代谢组数据的分析，由于其分析方法可以最大化组间差异常被用于差异代谢物的筛选[13]。在OPLS-DA分析中，Q2是一个重要的参数，若数值大于0.9，则可以反映该模型的可靠性与稳定性。图3b中可以看出，Q2为0.998，证实该模型可以用以下一步的差异代谢物分析。

图3 川陈皮与其混伪品代谢物的PCA(a)与OPLS-DA(b)分析。Fig.3 PCA(a) and OPLS-DA(b) analysis of metabolites of CCRP and its adulterant

3.3 差异代谢物的筛选、注释与富集

本文结合单变量分析的差异倍数值(fold change)与多变量分析OPLS-DA模型中变量重要性投影(variable importance in project，VIP)数值进行样品之间的差异代谢物筛选。筛选标准为选取fold change≥2或fold change≤0.5和VIP≥1的差异代谢物，即代谢物在组间差异为2倍以上或0.5倍以下以及VIP≥1，则认为差异显著[14]，由此共计筛选出52种差异代谢物。根据差异代谢物含量作聚类热图(图4)，由图可以清晰看出川陈皮样品与其混伪品间成分差异明显，而组内样品成分差异较小。

图4 川陈皮与其混伪品的代谢物聚类热图Fig.4 Metabolite clustering heatmap of CCRP and its adulterant

另以代谢物在样品中定量差异倍数的对数值为横坐标，VIP值为纵坐标绘制火山图差异代谢火山图(图5c)，横坐标越大，则表达量在两类样品间表达量倍数差异越大；纵坐标越大，差异表达越明显。从图5c中可以看出，上调化合物31种，下调化合物21种。另由2.1分析结果可知，川陈皮中鉴定出特有化合物15种，混伪品中鉴定出特有化合物16种，因此，可以判断川陈皮与其混伪品中的黄酮类化合物有显著差异，建议在临床使用上区别使用。

图5 川陈皮与其混伪品差异代谢物的KEGG分类图(a)、KEGG富集图(b)及火山图(c)Fig.5 KEGG classification(a),statistics of KEGG enrichment(b) and Volcanic plots(c) of differential metabolites of CCRP and its adulterant

川陈皮与混伪品之间差异代谢物经过数据库KEGG注释。KEGG分类与富集分析结果显示(图5a和5b)，差异代谢物主要参与花青素生物合成、黄酮与黄酮醇生物合成、黄烷酮生物合成和黄酮类生物合成。

4 讨论

本文基于UHPLC-ESI-MS/MS技术的代谢组学方法对川陈皮与其混伪品中的黄酮类化合物进行分析。结果表明，共鉴定出228种黄酮类化合物，包括多酚12种、花青素21种、黄酮类132种、黄酮醇36种、黄烷酮20种、异黄酮7种。川陈皮与混伪品所含黄酮类化合物差异较大，PCA分析、OPLS-DA分析与聚类分析均可显著区别。另共筛选出52种差异代谢物，其中川陈皮中鉴定出特有化合物15种，混伪品中鉴定出特有化合物16种。这些特征化合物均可作为鉴别川陈皮与混伪品的特征性成分。如川陈皮中特有成分姜黄素、根皮素类、花青素类及其苷类等化合物在临床上具有显著抗氧化、抗肿瘤、降血脂等功效，对其质量控制以及品质评价均有重要参考价值。

中国2015年版本《中国药典》陈皮项下规定，橘及其栽培变种均可作为陈皮药材来源品种。本文研究结果表明，不知火橘皮与川陈皮中的黄酮类化合物具有显著差异。进过文献查阅得知，不知火柑橘为现代柑橘杂交品种，是农学科学家为迎合消费者追求的舒服口感以及果农追求的经济价值高、抗病、高产需求而选育出来的杂交品种，物种基因组可能含有其他橙、柚品种的基因[15]。设想如橙或柚基于渗入橘杂交品种中，在改变橘甜度、口感、高产、抗病等农艺性状的时候，其药用部位有效成分、药效变异与传递是否等效值得深入研究。因此，建议加强对不同来源品种陈皮药材在基因、化学、药理作用等各方面变异值大小的评价研究，以筛选出适合临床使用的品种，确保临床用药的有效、安全与稳定。