冬凌草甲素促进人脑胶质瘤U251细胞放疗敏感性的研究

李长宇，宋少军，黄桂芳，祝 福，曹亚雷，金茂林，冉浩男

脑胶质瘤进展速度较快，可侵犯正常脑组织，浸润性生长导致颅内压逐渐升高，引起患者四肢乏力、恶心、头晕、癫痫发作等症状[1-2]。如何减轻脑胶质瘤引起的颅脑损伤症状、恢复神经细胞功能已经引起越来越多学者关注。冬凌草甲素是冬凌草的活性成分，具有减小脑梗死体积、抗氧化、抗炎、扩张血管、抗疲劳、抑制血小板聚集等药理作用[3-4]。本研究以人脑胶质瘤U251细胞株为模型，探讨了冬凌草甲素对U251细胞放射治疗(放疗)敏感性的影响，以期为脑胶质瘤治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料 冬凌草甲素(Sigma公司，DMSO溶解后配置成相应浓度备用)，人脑胶质瘤U251细胞株(美国ATCC公司)，DMEM培养基(北京索莱宝科技有限公司)，噻唑蓝(MTT)试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，V-FITC和PI染色试剂盒(美国BD公司)，ECL化学发光液(北京Solarbio公司)，Hoechst 33258荧光染色试剂盒、Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9抗体(上海碧云天公司)。

1.2方法

1.2.1人脑胶质瘤U251细胞培养：将人脑胶质瘤U251细胞培养于DMEM培养基(含有10%胎牛血清，链霉素100 mg/L，青霉素1×105U/L)中，置于37℃、5%CO2的培养箱，3 d换液一次，选取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2细胞分组：对照组为细胞常规培养，无其他干预。冬凌草甲素组在培养基中加入溶于DMSO的冬凌草甲素(10 μmol/L)，培养24 h。X线照射组：使用21EX型双光子高能直线加速器，剂量率为4 Gy/min，总剂量为6 Gy，照射结束后继续培养24 h。联合放疗(X线照射+冬凌草甲素)组：冬凌草甲素干预24 h后，给予X线照射。

1.2.3人脑胶质瘤U251细胞增殖抑制率：先配置MTT溶液(用PBS配置，将pH酸碱度调制7.4，配置MTT液浓度为5 mg/ml)，上述各组U251细胞培养于96孔板内，细胞密度为1×105/ml，弃去原有培养液，加入配置好的MTT液培养4 h，吸弃孔内上清液，每孔加150 μl DMSO液，摇床振荡5 min，在酶联免疫检测仪上用570 nm吸光度进行检测。

1.2.4人脑胶质瘤U251细胞凋亡荧光染色：采用Hoechst 33258荧光染色，人脑胶质瘤U251细胞经相应处理后用PBS液洗涤细胞2次，在150 μl 的Binding Buffer中加入2 μl Hoechst染液(10 μg/ml)避光反应15 min，弃去上清液，PBS液洗3遍，荧光显微镜下观察结果并拍照。

1.2.5流式细胞仪检测细胞凋亡：收集各组细胞悬液，调整细胞密度1×106/ml，磷酸盐缓冲液冲洗细胞后，分别加入10 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，轻柔振荡混匀，4 ℃避光反应30 min，流式细胞仪分析细胞凋亡水平。

1.2.6Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9的蛋白表达水平：采用Western Blot检测，提取蛋白质后，以Brandford法测定每个蛋白样品的蛋白浓度。每孔加入40 μg蛋白样品，然后行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压200 V，电泳40 min后转膜，5%脱脂奶粉溶液4℃封闭2 h，加一抗(稀释浓度1∶1000)过夜，洗膜后室温下孵育二抗(稀释浓度1∶2000)1 h，ECL化学发光法自显影并采集图像，利用样本目的蛋白光密度对比内参条带光密度，比较不同样本的相对表达率。

2 结果

2.1冬凌草甲素对放疗后人脑胶质瘤U251细胞增殖的影响 4组细胞的增殖率分别为：对照组(101.38±4.07)%、冬凌草甲素组(65.47±5.97)%、X线照射组(68.79±3.05)%、联合放疗组(44.43±5.27)%。与对照组相比，冬凌草甲素组、X线照射组、联合放疗组细胞增殖率降低，且联合放疗组低于冬凌草甲素组和X线照射组，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2人脑胶质瘤U251细胞凋亡形态学比较 正常细胞的细胞核在荧光显微镜下表现为弥散浅蓝色弱荧光；凋亡的细胞核表现为致密的亮蓝色强荧光。4组细胞凋亡率分别为：对照组(4.66±2.73)%、冬凌草甲素组(25.03±7.56)%、X线照射组(24.83±6.07)%，联合放疗组(44.43±5.27)%。与对照组相比，冬凌草甲素组、X线照射组、联合放疗组凋亡细胞率增高，且联合放疗组高于冬凌草甲素组和X线照射组，差异有统计学意义(P<0.05)见图1。

图1 4组人脑胶质瘤U251细胞凋亡情况(Hoechst×200)

2.3流式细胞计数人脑胶质瘤U251细胞凋亡率比较 4组细胞凋亡率分别为对照组(4.13±3.52)%、冬凌草甲素组(31.03±4.71)%、X线照射组(22.58±5.73)%，联合放疗组(43.61±5.10)%。与对照组相比，冬凌草甲素组、X线照射组、联合放疗组细胞凋亡率增高，且联合放疗组高于冬凌草甲素组和X射线照射组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图2 流式细胞计数检测4组人脑胶质瘤U251细胞凋亡率比较

2.4冬凌草甲素对放疗后人胶质瘤U251细胞Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9表达的影响 与对照组比较，冬凌草甲素组及X线照射组、联合放疗组Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9表达水平均升高，且联合放疗组高于冬凌草甲素组和X线照射组(P<0.05)。见表1和图3。

表1 4组Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9蛋白相对表达水平比较

图3 冬凌草甲素对U251细胞内Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9表达水平的影响

3 讨论

脑胶质瘤患者临床表现多样，同样大小的脑胶质瘤在不同患者身上表现的症状也不相同，可长期无任何症状或仅出现轻微症状。上述表现与肿瘤本身的占位效应、日益增高的颅内压及肿瘤周围区域的肿胀有关。脑胶质瘤在神经系统以外的转移非常罕见，部分手术患者仅表现为局部复发，或者扩展到颅内的其他部位[5-6]。高级别的脑胶质瘤很难通过手术完全切除，因此，有效的放化疗对提高该类患者的生活质量，延长患者生存期至关重要。

脑胶质瘤综合治疗包括手术、化疗和放疗。放疗是通过各种不同能量射线给予肿瘤组织均匀准确的照射，以抑制和杀灭癌细胞[7]，可单独使用，也可与手术、化疗等配合。由于肿瘤组织中乏氧细胞的存在，对放射线的耐受比氧细胞至少高3倍，常规放疗不能杀死乏氧细胞，限制了放疗的效果，这也是肿瘤复发和转移的根源[8-10]。

文献报道，冬凌草甲素具有抑制肿瘤细胞生长的作用，针对不同的肿瘤细胞，其抑制途径各不相同[11-12]。X线照射细胞后，会引起细胞内一系列改变，包括分子、代谢水平、骨架结构和功能等，以应对X线的损伤[13-14]。本实验结果显示，与对照组相比，冬凌草甲素组、X线照射组及联合放疗组人脑胶质瘤U251细胞增殖率降低，且联合放疗组低于冬凌草甲素组及X线照射组。与对照组比较，冬凌草甲素组、X线照射组及联合放疗组人脑胶质瘤U251细胞凋亡率增高，且联合放疗组高于冬凌草甲素组及X线照射组。说明单用冬凌草甲素或放疗对人脑胶质瘤U251细胞的直接抑制作用有限，但二者联合应用，能够增加U251细胞放疗敏感性，表现为细胞增殖率明显下降及凋亡率增加。Caspase家族在介导细胞炎症、应激和凋亡过程中发挥着重要作用[15-18]。本研究结果显示，与对照组相比，冬凌草甲素组和X线照射组均能上调U251细胞内的Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9的表达，且联合放疗组高于冬凌草甲素组及X线照射组。说明Caspase-3及Caspase-9共同参与了冬凌草甲素促进U251细胞放疗敏感性的调节过程。

综上所述，利用药物增加生物体的放疗敏感性，对脑胶质瘤的临床治疗有重要意义；冬凌草甲素可显著提高脑胶质瘤U251细胞的放疗敏感性，在脑胶质瘤的治疗方面具有重要价值。