UPLC测定超声提取冬凌草中冬凌草甲素的含量

赵 鹏， 余旭亚， 黄遵锡 ， 唐湘华， 李俊俊

(1.生物能源持续开发利用教育部工程研究中心，云南昆明 650092;2.云南师范大学生命科学学院，云南昆明 650092;3.昆明理工大学生命科学与技术学院，云南昆明 650224)

冬凌草学名碎米亚，是唇形科香茶菜属植物Rabdosia rubescens(Hemsl.)Hara又称Isodon rubescens(Hemsl.)C.Y.Wu et Hsuan。冬凌草甲素是冬凌草中主要活性成分，在体内和体外均具有较强的抗肿瘤和抗菌活性［1-3］，其分析方法有比色法［4］、薄层扫描法［5］、HPLC［6］和 HPCE［7］等。其中比色法和薄层扫描法存在定量不准确的缺点;HPCE法虽然快速、试剂用量少且柱不易受污染而优于HPLC，但是进样精度较HPLC低，存在重现性较差、线性范围窄和灵敏度较低等缺陷。目前HPLC法是较为常用的冬凌草甲素的测定方法。本实验采用UPLC测定冬凌草中冬凌草甲素含量，比常规HPLC省时9 min以上，是一种简便、快捷、高效、准确的检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

ACQUITY UPLC(美国 Waters公司)，ACQUITY UPLC PDA检测器(美国Waters公司)，Empower 2色谱数据工作站(美国 Waters公司);超声波提取器(Automatic Science，60W);冬凌草甲素对照品购自西安旭煌生物技术有限公司(批号090621);冬凌草全草药材购自市场;乙腈(美国Fisher公司，色谱纯);甲醇(AR);水为超纯水。

1.2 色谱条件

Acquity UPLC BEH C18超高效色谱柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm);柱温40℃;样品室温度8℃;检测波长242 nm，进样量为 1 μL。

表1 洗脱梯度

1.3 对照品贮备液的制备

准确称取冬凌草甲素对照品5.5 mg，甲醇溶解并定容到25 mL，制得0.22 mg/mL的冬凌草甲素对照品溶液。

1.4 样品溶液的制备

取冬凌草全草药材，粉碎过40目筛，精密称取1 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL称重，超声处理40 min，放至室温，称重，用甲醇补至原重，过滤，取滤液2 mL，甲醇定容至10 mL，经微孔滤膜(0.22 μm)滤过作为供试样品溶液。

2 结果与讨论

2.1 系统适用性试验

样品溶液及对照品溶液依次进样，获得色谱图(见图1)。可以从图中看出，冬凌草甲素与相邻峰的分离度达到完全基线分离。

图1 冬凌草甲素对照品(A)和冬凌草全草(B)UPLC图

2.2 线性关系考察

精确吸取对照品溶液 0.1、0.2、0.4、0.6、1.0、2.0 μL 按文中1.2项下色谱条件分别进样，以对照品溶液进样量(μg)为横坐标(X)，峰面积积分值为纵坐标(Y)，计算回归方程为Y=3×106X+25246，r=0.999 7，冬凌草甲素进样量在0.022～0.44 μg呈良好的线性关系。

2.3 样品溶液稳定性试验

取冬凌草粗粉(样品1)，按文中1.4项下制备样品溶液，在0、2、4、6、8、12 h 按1.2 项下色谱条件分别进样，记录峰面积平均值为346 273，RSD 1.04%。结果表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.4 进样精密度试验

取冬凌草粗粉(样品1，湖北金贵)，按1.4项下制备样品溶液，按1.2项下色谱条件进样5次，测得冬凌草甲素平均含量为6.662%，RSD 0.35%，表明进样精密度较好。

2.5 重复性试验

取冬凌草粗粉(样品1)5份，按1.4项下方法制备，按1.2项下色谱条件分别进样测定，测得平均含量为6.744%，RSD 1.93%，表明方法的精密度较好。

2.6 回收率试验

分别精密吸取0.192 mg/mL的冬凌草甲素对照品溶液5份，每份2 mL，分别加入约1 g已知含量的冬凌草粗粉(样品1)中。按1.4项下方法处理，按1.2项下色谱条件分别进样，冬凌草甲素的平均回收率为97.3%，RSD 1.05%，结果见表2。

2.7 样品测定

采用文中1.4项下方法，对多个不同来源的冬凌草样品进行处理，用文中1.2项下色谱方法进行测定，记录峰面积，计算冬凌草甲素的含量。见表3。

表2 冬凌草甲素回收率试验结果(n=5)

表3 冬凌草全草药材中冬凌草甲素含量测定结果(n=5)

3 结论

本实验采用UPLC对冬凌草药材中冬凌草甲素的含量进行测定，与常用的 HPLC测定方法［6，8-9］相比，在保持较高的准确度和精密度的同时，提高了分析效率。甲素的保留时间从10 min以上缩短为1.361 min，出峰时间缩短了9 min以上，分析时间缩短至3 min以内，在分析时间大幅缩短的同时，减少了溶剂的损耗和废液的处理费用，节省了分析成本，为提高冬凌草的质量控制及其新产品的开发利用提供了一种更为快速准确测定方法。

［1］Kadota S，Basnet P，Ishii E，et al.Antibacterial activity of trichorabdal A from Rabdosia trichocarpa against Helicobacter pylori［J］.Zentralblatt Für Bakteriologie，1997，286(1):63-67.

［2］Chen S，Gao J，Halicka HD，et al.The cytostatic and cytotoxic effects of oridonin(Rubescenin)，a diterpenoid from Rabdosia rubescens，on tumor cells of different lineage［J］.Int J Oncol，2005，26(3):579-588.

［3］Liu J J，Huang R W，Lin D J，et al.Oridonin-induced apoptosis in leukemia K562 cells and its mechanism ［J］.Neoplasma，2005，52(3):225-230.

［4］赵清治，晁金华，王汉清.注射剂“癌得宁”中冬凌草甲素含量的紫外分光光度定量测定［J］.河南医学院学报 医学版，1981，16(2):351-354.

［5］袁 珂，胡润淮.薄层扫描法测定冬凌草中冬凌草甲素的含量［J］. 中药材，1997，20(5):242-243.

［6］袁 珂，吕洁丽，贾 安.超声提取HPLC法测定冬凌草中冬凌草甲素［J］. 中草药，2005，36(12):1823-1824.

［7］贾 欣，高 岩，杜 斌，等.HPCE法测定冬凌草片中冬凌草甲素的含量［J］. 郑州大学学报，2006，41(1):156-157.

［8］冀春茹，冯卫生，胡润淮，等.HPLC法测定冬凌草萜含片中冬凌草甲素的含量［J］.中国现代应用药学杂志，1999，16(5):35-36.

［9］李可强，王 坤，张振秋.HPLC切换波长法同时测定冬凌草片中迷迭香酸和冬凌草甲素含量［J］.中成药，2008，30(4):526-528.