毛细管电泳法测定天山花楸中的黄酮类化合物

马晓丽， 常军民， 李毓斌， 孟 磊

(1.新疆医科大学分析测试中心;2.新疆医科大学药学院，新疆乌鲁木齐 830054)

天山花楸Sorbus tianschanicaRuper.为蔷薇科Rosacea花楸属Sorbus植物天山花楸Sorbus tianschanicaRuper.的干燥嫩枝叶，主产于新疆的天山山脉，是维吾尔民间习用药材之一，药理学研究证明其具有镇咳、祛痰、平喘、强心和保护心肌缺血等作用［1－2］。黄酮类化合物在天山花楸中分布较广，是其主要活性成分之一［3］。

天山花楸中黄酮类成分的检测方法大多采用HPLC法［4－9］而且多为单一成分检测。高效毛细管电泳法［10－12］是近年发展起来的一种具有高效、灵敏和低耗的分析方法，已广泛应用于中草药的活性成分测定。本实验首次采用高效毛细管电泳法研究天山花楸干燥枝叶中的3种黄酮类成分(芦丁、金丝桃苷和槲皮素)，旨在建立一种简单、快速能同时分离测定天山花楸中芦丁、金丝桃苷和槲皮素含量的方法，以期为天山花楸资源的开发和利用提供基础依据。

1 仪器与试药

Beckman P/ACETM MDQ型高效毛细管电泳仪(Beckman公司，美国)，二极管阵列检测器，石英毛细管柱(58.5 cm × 75 μm，有效长度 48.5 cm，河北永年);FE20－pH 计(METTLER TOLEDO公司);XS205电子天平(METTLER TOLEDO)。

芦丁、金丝桃苷和槲皮素对照品均购于中国药品生物制品检 定 所 (批 号 分 别 为:100080－200306，111521－200303，100081－200406)。天山花楸采自新疆呼图壁县林场，并经新疆医科大学药学院生药教研室帕丽达.阿不力孜教授鉴定。试剂均为分析纯，水为去离子水。

2 方法与结果

2.1 电泳条件

石英毛细管柱(58.5 cm×75 μm，有效长度48.5 cm);运行缓冲液:10 mmol/L的Na2B4O7－20 mmol/L的NaH2PO4(pH8.30);分离电压20 kV(+)→(－);电泳时间20 min;电泳温度25℃;压力进样0.5psi×20s;柱上检测UV 254 nm(二极管阵列检测器)。清洗程序:第一次进样前分别以甲醇、双蒸水、0.1mol/L盐酸、双蒸水、0.1mol/L NaOH、双蒸水、缓冲溶液冲洗毛细管20psi×3min;每次进样间用0.1 mol/L NaOH 冲洗20psi×5 min，双蒸水冲洗20psi×5 min，最后用缓冲溶液冲洗20psi×5 min。每变换一次电泳缓冲液，均用缓冲液平衡至电流平稳(10 min)后才能进样测量。样品及缓冲液均在4℃储存，在使用前用0.45 μm微孔滤膜滤过，且临用前超声脱气处理。

2.2 对照品贮备液的制备

分别精确称取芦丁、金丝桃苷及槲皮素对照品各10.0 mg，置于10 mL量瓶内，以甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度分别为1 mg/mL的对照品贮备液;放置－4℃冰箱中保存，在使用前按要求稀释。

2.3 供试品的制备

样品研磨均匀，过20目筛，精密称取5.0 g，置于100 mL具塞三角瓶中，加甲醇50 ml超声提取(30 min×3)，合并提取液，4 000 r/min离心15 min，取上清液将甲醇挥尽，用水溶解，再用乙醚萃取，将水溶液浓缩至10 mL，摇匀，制成供试品溶液，放置－4℃冰箱中保存。

2.4 线性关系考察

分别精密吸取0.0625，0.125，0.185，0.25，0.375 mL 芦丁对照品贮备液置于5个10 mL量瓶中，并依次加入金丝桃苷对照品贮备液 0.125、0.25、0.375、0.5、0.67 mL 及槲皮素对照品贮备液 0.025、0.05、0.075、0.1、0.13 mL，后用甲醇稀释至刻度，摇匀作为对照品混合液，经0.45 μm微孔滤膜滤过，进样，记录色谱图，以峰面积为纵坐标，以相应进样浓度为横坐标进行线性回归。结果表明混合标准品在线性范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系，结果见表1，电泳图见图1。

图1 芦丁、金丝桃苷、槲皮素混合标准品的CZE图

表1 芦丁、金丝桃苷、槲皮素线性关系考察结果

2.5 进样精密度考察

考察所建立方法在相同操作条件下短时间内的精密度:取对照品混合液(芦丁25 μg/mL，金丝桃苷50 μg/mL，槲皮素10 μg/mL)，连续5次重复进样分析每次进样20 s，测得芦丁、金丝桃苷、槲皮素对照品峰面积的RSD分别为0.9%，1.2%，2.7%。迁移时间的 RSD分别为0.14%、0.13%、0.14%。结果表明，此分析方法精密度好。

2.6 稳定性实验

取对照品混合液(芦丁25 μg/mL，金丝桃苷50 μg/mL，槲皮素10 μg/mL)，每隔2 h连续12 h考察样品的日内稳定性，每次进样20s。测得芦丁、金丝桃苷、槲皮素对照品峰面积的RSD分别为1.7%，1.8%，2.7%。迁移时间的RSD分别为0.80%、1.04%、1.36%。结果表明芦丁、金丝桃苷及槲皮素对照品溶液的日内稳定性好。

2.7 方法重现性实验

取同一批次天山花楸样品各6份，按2.3项下操作制备样品溶液，经测定样品中芦丁、金丝桃苷及槲皮素峰面积的RSD%分别为1.1%，0.4%，2.6%，迁移时间的RSD%分别为0.14%，0.12%，0.10%。结果表明，该方法对芦丁、金丝桃苷和槲皮素的含量测定具有较好的重现性。

2.8 加样回收率

取已知含量的样品，定量加入混合对照品，以2.3项进行处理，重复测定6次，测得吸收峰面积，计算回收率，结果见表2。

表2 回收率测定结果(n=6)

2.9 样品测定

取不同时间采集的天山花楸样品，每种样品按照供试品制备方法值得天山花楸供试品液3份，使用前精密吸取贮备液1 mL，置于10 mL量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜滤过，进样分析。采用外标法测定样品，计算含量，结果见表3，电泳图见图2。

表3供试品测定结果

3 讨论

电泳缓冲液对分离的影响:实验结果表明，在相同实验条件下，使用Na2HPO4－NaH2PO4时，3种黄酮类成分分离不好，峰拖尾严重;在Na2B4O7－NaH2PO4时，由于黄酮类化合物在碱性条件下可与硼酸根离子络合从而增加溶解度减少吸附引起的拖尾，3种化合物达到基线分离，峰形对称。缓冲液的酸度和浓度对分离具有明显的影响。3种黄酮类成分的分离度随硼砂缓冲液pH值增加而提高，但当pH值过高时，电流增加过高，基线噪音增加，各峰的保留时间都增加，且出现拖尾现象，在硼砂浓度为10 mmol/L，缓冲液pH8.3时，得到较理想的CZE分离效果，3种成分的分离度R＞1.5。本实验还考察25，20，15，10，5 kV等不同CZE电压条件对样品分离的影响。结果表明，当分离电压低于15 kV时，电流减小，谱峰展宽;电压为20 kV，电流稳定，分离效果良好;同时柱温考察结果表明，25℃柱温较为理想，大于或小于此温度，各组分对照品的CZE峰不能达到完全基线分离。

图2

通过CZE分离条件的优化，本实验选择缓冲体系为10 mmol/L 的 Na2B4O7－20 mmol/L 的 NaH2PO4(pH8.30)，电压20 kV，柱温25℃的CZE分离体系，能得到较理想的分离效果。

4 结论

本实验在优化的电泳条件下对天山花楸中的黄酮类成分(芦丁、金丝桃苷及槲皮素)进行了含量测定。结果表明，不同采集年份的天山花楸中黄酮类成分的含量存在一定的差异，2007年采集的天山花楸中金丝桃苷含量最高。采用毛细管电泳法测定天山花楸中黄酮类成分具有简便、快速、准确、低耗等特点，适合于天山花楸中黄酮类组分的含量测定。

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