HPLC法同时测定麝香抗栓胶囊中马钱苷、葛根素和芍药苷成分的含量

季文媛,刘炜*

(1.首都医科大学附属北京世纪坛医院药剂科，北京 100038； 2.临床合理用药评价北京市重点实验室，北京 100038； 3.临床合理用药评价国际合作联合实验室，北京 100038)

麝香抗栓胶囊由人工麝香、羚羊角、忍冬藤、粉葛、大黄、赤芍、川芎、乌梢蛇等二十二味药材组方，采用粉碎、煎煮、干燥、混合等工艺制备而成的中成药胶囊剂，具有通络活血、醒脑散瘀等功效，常用于中风气虚血瘀症，临床症见半身不遂、言语不清、头昏目眩等[1-3]。二十二味药材中粉葛具有解肌退热、生津止渴、透疹、升阳止泻、通经活络、解酒毒等功效[4-7]，忍冬藤具有清热解毒、疏凤通络等功效[8-11]，赤芍具有清热凉血、散瘀止痛等功效[12-15]。

目前，人口老龄化已是严峻的社会问题，随着老龄化的趋势不断升级，老年中风患者增多，麝香抗栓胶囊在临床上应用也将越来越广[16-18]。2015年版《中国药典》[19]收载的麝香抗栓胶囊仅针对赤芍药材进行含量测定，不能较好地指示该产品的质量水平，且给制假、售假等不法分子可趁之机。为保障用药安全，本文建立反相高效液相色谱法同时测定麝香抗栓胶囊中马钱苷、芍药苷和葛根素成分含量的分析方法，为进一步提高麝香抗栓胶囊的质量控制水平提供技术参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1200型液相色谱仪：配备二极管阵列检测器，open-lab工作站(美国安捷伦公司)；Phenomonex®luna-C18液相色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美国菲罗门公司)；Sartorius CPA-225D型十万分之一电子天平(德国赛多利斯公司)；HT-350A型超声波清洗机(山东亨通电子设备厂)；Milli-Q®IQ 7000型纯水仪(美国密理博公司)。

1.2 试药与试剂

葛根素对照品(批号：110752-201816，质量分数95.4%)、芍药苷对照品(批号：110736-201943，质量分数95.1%)、马钱苷对照品(批号： 111640-201808，质量分数99.0%)均购自中国食品药品检定研究院；组方中药材：购自国药集团台州中药厂，均按照《中国药典》经刘炜主任药师鉴定；麝香抗栓胶囊(批号：190615、190912、191204，吉林省七星山药业有限公司)；甲醇、乙腈(HPLC级，美国Merck试剂公司)；H3PO4(优级纯，国药集团上海化学试剂厂)；实验用水(超纯水，纯水机制)；其他试剂(分析纯，国药集团上海化学试剂厂)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Phenomonex®luna-C18液相色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；检测器：二极管阵列检测器；检测波长：241 nm；流速：1.2 mL/min；柱温：27 ℃；进样体积：20 μL；流动相为乙腈(A)- 0.5% H3PO4溶液，梯度洗脱(0～5 min，5%A；5～19 min，5%～36%A；19～27 min，36%～75%A；27～29 min，75%A；29～30 min，75%～5%A；30～35 min，5%A)。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品储备液的制备 取马钱苷、葛根素、芍药苷对照品适量，精密称定，置同一100 mL量瓶中，加95%(体积分数，下同)甲醇溶液制备每1 mL含马钱苷39.60 μg、葛根素76.32 μg、芍药苷475.50 μg的对照品储备液，用95%甲醇溶液定容至刻度，摇匀，即得。

2.2.2 对照品溶液的制备 取“2.2.1”项下对照品储备液，精密量取适量，置50 mL量瓶中，加95%甲醇溶液分别制备每1 mL溶液含马钱苷3.96 μg、葛根素7.63 μg、芍药苷47.55 μg的对照品溶液，用95%甲醇溶液定容至刻度，摇匀，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备 取麝香抗栓胶囊20粒，去除囊壳，将内容物混匀；再取混匀后的粉末约1.0 g，精密称定，置50 mL量瓶中，加95%甲醇溶液约40 mL，超声提取20 min(功率300 W，频率50 kHz)，取出，放冷，用95%甲醇溶液定容至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得。

2.2.4 阴性对照溶液制备 按麝香抗栓胶囊药材配比比例和制备工艺方法制备缺粉葛、赤芍和忍冬藤的阴性对照样品，按“2.2.3”项下供试品溶液配制方法进行前处理，得阴性对照溶液。

2.3 专属性试验

分别取“2.2”项对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液，按“2.1”项色谱条件分别进样20 μL，采集液相色谱图(见图1)。可见，葛根素、芍药苷和马钱苷与相邻峰分离度均大于1.5，且在3种成分相应色谱峰位置，阴性对照溶液无干扰峰，3种成分理论塔板数均大于3 000，表明方法专属性良好。

1.马钱苷； 2.葛根素； 3.芍药苷； A.对照品溶液； B.空白溶液； C.阴性对照溶液； D.供试品溶液。

2.4 线性关系的考察

取“2.2.1”项对照品储备液，分别精密移取1.0、2.0、5.0、10.0、25.0 mL，置50 mL量瓶中，分别制备含马钱苷、葛根素和芍药苷的系列标准溶液，按“2.1”项色谱条件分别进样20 μL，采集液相色谱图；以3种成分质量浓度(X)为横坐标，色谱图中峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归，计算标准曲线方程。结果见表1。

表1 3种成分的标准曲线方程、相关系数及线性范围Table 1 Standard curve equation, correlation coefficient and linear range of three components

2.5 精密度试验

取“2.2.2”项下对照品溶液，按“2.1”项色谱条件连续6次进样20 μL，采集液相色谱图，计算峰面积相对标准偏差(RSD)。结果马钱苷、葛根素和芍药苷峰面积RSD值分别为1.45%、1.12%和1.01%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验

取同一批次麝香抗栓胶囊(批号：190615)样品6份，分别按“2.2.3”项方法制备供试品溶液；按“2.1”项色谱条件分别进样20 μL，采集液相色谱图，计算6份供试品溶液中马钱苷、葛根素和芍药苷平均质量分数分别为0.23、0.39、1.42 mg/g，RSD值分别为3.64%、2.89%和3.02%，表明方法重复性良好。

2.7 稳定性试验

取麝香抗栓胶囊(批号：190615)样品，按“2.2.3”项方法制备供试品溶液，于室温下分别放置0、3、6、9、12、24 h后取样，按“2.1”项色谱条件分别进样20 μL，采集液相色谱图，计算得马钱苷、葛根素和芍药苷峰面积RSD值分别为1.51%、1.44%和1.29%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.8 加样回收率试验

取已测定质量分数的麝香抗栓胶囊(批号：190615)样品，共取20粒，去除胶囊壳，将内容物混匀，取混匀后的粉末约0.5 g，精密称定，置50 mL量瓶中，共称取6份，分别按表2所示加入马钱苷、葛根素和芍药苷对照品适量，按“2.2.3”项方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件分别进样20 μL，采集液相色谱图，计算马钱苷、葛根素和芍药苷的加样回收率，结果见表2。可见，3种成分的平均回收率分别为98.2%、99.5%、99.7%，RSD值分别为2.24%、2.51%、2.04%，表明方法准确度良好。

表2 马钱苷、葛根素和芍药苷加样回收试验结果Table 2 The results of the recovery of puerarin, paeoniflorin and loganin

2.9 样品中马钱苷、葛根素和芍药苷质量分数的测定

取麝香抗栓胶囊，按“2.2.3”项下供试品溶液配制方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件分别进样20 μL，采集液相色谱图，计算供试品中马钱苷、葛根素和芍药苷的质量分数，结果测得3种成分的平均质量分数分别为0.24、0.39、1.45 mg/g，见表3。

表3 3批麝香抗栓胶囊样品的质量分数测定结果Table 3 Determination results of three batches of Shexiang kangshuan capsules(n=3) w/(mg·g-1)

3 讨论

3.1 检测波长的确定

本研究采集了190～400 nm波长范围内的光谱图，结果显示马钱苷、葛根素和芍药苷分别在238、249、232 nm处有最大吸收，3种待测成分最大吸收波长接近，为使3种成分响应良好，定性、定量准确，最终确定241 nm作为检测波长，结果证明选择该波长时，3种成分响应良好，且定性、定量结果准确。

3.2 流动相的确定

本研究比较了不同比例的甲醇-水和乙腈-水作为流动相的效果，发现在流动相中加入适量磷酸有助于改善待测成分的峰型，进一步比较甲醇-0.5%磷酸溶液和乙腈-0.5%磷酸溶液2种流动相体系对马钱苷、葛根素和芍药苷分离的影响。结果表明选择乙腈-0.5%磷酸溶液流动相体系时，3种成分分析时间短、分离效果最佳。

3.3 提取溶剂的确定

麝香抗栓胶囊是由忍冬藤、粉葛、赤芍等二十二味药材加工制成，药味较多，基质比较复杂，本研究分别考察提取溶剂为甲醇、95%甲醇溶液、85%甲醇溶液和75%甲醇溶液时对提取效果的影响，结果表明选择95%甲醇作为提取溶剂时，提取效果最佳且基质无干扰，因此选择95%甲醇作为提取溶剂。

本文建立了同时测定麝香抗栓胶囊中马钱苷、葛根素、芍药苷成分质量分数的高效液相色谱法，方法简便、准确、重复性好，可为全面保证该产品的质量提供技术参考。