甘露糖对巨噬细胞炎症反应的双向调节作用

吴惠娟，韦曲星，张盛昔，胡因铭，王乐旬

（广东省代谢病中西医结合研究中心//广东省代谢性疾病中医药防治重点实验室//粤港澳联合代谢病重点实验室//广东药科大学中医药研究院，广东广州 510006）

甘露糖（mannose，Man），是一种6 碳单糖，为葡萄糖的一种异构体，主要以甘露聚糖、半纤维素和纤维素等聚糖的形式存在于植物、微生物和动物体内［1-2］。少量游离的甘露糖存在于柑橘、苹果和桃等多种水果中［1，3］。正常情况下，哺乳动物体内甘露糖的浓度约为50～100 μmol/L［2，4］，人体血浆中甘露糖的浓度不超过50 μmol/L［2，5］。甘露糖主要借助于细胞膜上的己糖转运受体通过易化扩散的方式进入细胞［2］。进入细胞的甘露糖被己糖激酶（hexokinase，HK）催化生成甘露糖6磷酸（mannose-6-phoshpate，M6P），然后被磷酸甘露糖异构酶（phosphomannose isomerase，PMI）催化生成果糖6磷酸，进入糖酵解途径分解（约占95～98%），或者被磷酸甘露糖变位酶（phosphomannomutase，PMM2）催化生成甘露糖1 磷酸，参与蛋白质糖基化途径（约占2%）［2，4-5］。甘露糖具有重要的生理功能，比如可促进肠道菌群的平衡和促进胰岛素的分泌等；其还可作为维生素合成、抗肿瘤药物以及免疫调控药物的成分［1］。另外，甘露糖具有无毒副作用、甜味强和低热量的特点，常作为食品添加剂用于食品的生产［1］。正是由于甘露糖的诸多优点和应用，使其受到越来越多的关注和研究。随着对甘露糖研究的深入，发现甘露糖对炎症反应具有重要的调控作用。研究［6］显示甘露糖可以抑制皮肤损伤引起的炎症，以及抑制活化的白细胞通过与透明质酸的结合而在损伤部位的聚集。另外，甘露糖不仅通过抑制中性粒细胞氧化爆发进而抑制炎症反应［7］，还可通过诱导T淋巴细胞向Teg细胞分化进而抑制气道的炎症反应［8］。此外，在动物水平上，甘露糖可显著抑制LPS 所致的急性肺损伤［9-11］。上述研究大都为现象的描述，没有在巨噬细胞上探讨不同浓度下甘露糖单糖对炎症调控的作用及其机理。本研究以LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7作为体外炎症细胞模型，观察不同剂量甘露糖单糖对炎症状态下细胞内炎症因子mRNA 水平及其蛋白表达的影响，并探讨其对炎症相关信号通路的调控，进一步明确甘露糖对炎症的调控作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株

RAW264.7 小鼠巨噬细胞购自中国科学院细胞库，用含有100 U/mL 的青霉素和0.1 mg/mL 的链霉素以及100 mL/L 的胎牛血清的DMEM 低糖培养基于37°C、体积分数5%CO2培养箱中常规培养。

1.2 试剂及仪器

DMEM 培养基、胎牛血清、青/链霉素、HRP 标记的羊抗鼠IgG 和羊抗兔IgG 购自Thermo Fisher Scientific 公司；台盼蓝、Man 和脂多糖（LPS）购自Sigma-Aldrich 公司；iNOS 抗 体购自Abcam 公司；GAPDH 抗体购自ProteinTech 公司；p-STAT3、STAT3、p-p65、p65、p-ERK 和ERK 抗体购自Cell Signaling Technology 公司；CD206 抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；硝酸纤维素膜为Millipore公司产品；ECL 发光液为武汉聚能慧达生物科技有限公司产品；RNAiso-Plus 试剂为Takara 公司产品；IL-6、IL-10、TNF-α、IL-1β 和CCL2 的ELISA试剂盒为江苏菲亚生物科技有限公司产品；逆转录试剂盒和荧光定量PCR 试剂盒购自TOYOBO公司；蛋白定量试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；牛血清白蛋白（BSA）、Western 细胞裂解液为上海碧云天生物技术公司产品。LightCycler 480 荧光定量PCR 仪为Roche 公司产品；5810R 低温离心机为Eppendorf 公司产品；NanoDrop 2000核酸浓度测定仪为Thermo Fisher Scientific 公司产品；Mithras LB-940 酶标仪购自德国Berthold 公司；电泳仪及转膜仪为Bio-Rad 公司产品。

1.3 细胞计数检测增殖情况

将对数生长期的RAW264.7细胞种于6孔培养板中，每孔含有5×105个细胞，待细胞贴壁后，加入0、1.25、2.5、5、10、20、40 mmol/L 的甘露糖，继续培养24 h。然后消化、收集细胞，0.4%的台盼蓝染色，计数活细胞的数量。

1.4 细胞处理

将RAW264.7 细胞种于6 孔培养板中，每孔含有1×106个细胞，加入不同浓度的甘露糖预处理12 h后，加入LPS（50 ng/mL），设置对照组、LPS组、Man低剂量组（2 mmol/L，Man2）、Man 高剂量组（20 mmol/L，Man20）、LPS+Man2 组和LPS+Man20 组，然后处理8 h 或24 h，收集细胞提取mRNA、蛋白质或培养上清进行后续检测试验。

1.5 Q-PCR检测细胞内mRNA表达

mRNA 提取、Q-PCR 过程详见参考文献［12］。引物由上海英潍捷基公司合成，序列见表1。

1.6 Western blot检测细胞内蛋白的变化

过程详见参考文献［12］。

1.7 ELISA检测细胞培养上清炎症因子的含量

收取刺激24 h后的培养上清及培养液，按照上述计数方法计数活细胞数量，并按照试剂盒说明书进行操作，检测上清中IL-12、IL-6、TNF-α、IL-1β和CCL2的含量，最终计算每106个细胞所分泌的炎症因子的蛋白量。

1.8 网络药理学方法预测甘露糖及其代谢产物的靶点

1.8.1 作用靶点预测 通过有机小分子生物活性数据库PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/search/）查询甘露糖与及其代谢产物甘露糖-6-磷酸的SMILE 结构。将查询到的SMILE 结构输入SwissTargetPrediction 数据库（http：//www.swisstar⁃getprediction.ch/）获取甘露糖与甘露糖-6-磷酸的作用靶点，并导入Uniprot 数据库（http：//www.uni⁃prot.org/）进行基因标准化。

1.8.2 炎症靶点预测 通过DisGeNET数据库（http：//www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu/home）检索与炎症有关的靶点基因，经UniProt统一为基因名。

1.8.3 甘露糖及甘露糖-6-磷酸炎症靶点收集 将甘露糖、甘露糖-6-磷酸和炎症靶点导入Excel表格，通过“重复值”找出甘露糖或露糖-6-磷酸与炎症的共同靶点。

1.8.4 通路分析 将化合物与炎症的共有靶点导入DAVID 6.8 数据库（https：//david.ncifcrf.gov/），物种选择小鼠（Mus musculus，mouse），进行京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，按照P＜0.05筛选出炎症相关通路。

表1 Q-PCR引物序列Table 1 Primer sequences for Q-PCR

1.8.5 网络构建 将整理好的化合物-靶点关系导入Cytoscape 3.6.1软件构建“化合物-靶点”网络。

1.9 统计学方法

采用GraphPad Prism 7 软件（GraphPad Software公司）进行统计分析，计量资料采用均数±标准差表示。样本数据首先进行正态性检验和方差齐性检验，对于符合正态分布且方差齐性的数据，采用单因素方差分析（ANOVA），多重比较采用Tukey 检验；不符合正态分布或方差不齐的数据采用H检验。P＜0.05 认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度甘露糖对RAW263.7 细胞增殖的影响

首先，我们验证了不同浓度的甘露糖对巨噬细胞增殖的影响。实验结果显示，不同浓度的甘露糖处理细胞24 h 后，5 mmol/L 组的细胞数量最多，为（2.20±0.10）×106，约为对照组（1.55±0.07）×106的1.4 倍（图1）。在5 mmol/L 以下，随着浓度的增加，细胞数量随之增加；在5 mmol/L以上，随着甘露糖浓度的增加，细胞数量随之降低，但没有低于对照组。48 h 的细胞增殖趋势与24 h 的类似（图1）。鉴于此，我们选择了甘露糖的两个浓度：2 mmol/L（低浓度）和20 mmol/L（高浓度）进行后续的实验。

2.2 不同浓度甘露糖对LPS 刺激的巨噬细胞中炎症因子mRNA水平的影响

和对照组相比，LPS 能够显著增强RAW263.7细胞中IL-1β（P=0.000）、IL-6（P=0.000）、IL-12（P=0.000）、CCL2（P=0.000）和TNF-α（P=0.000）的mRNA 水平（图2）。利用2 mmol/L 的甘露糖预处理后，能够显著增强LPS对IL-1β（P=0.000）、IL-12（P=0.0004）和TNF-α（P=0.025）的mRNA 水平的刺激。然而，20 mmol/L 的甘露糖预处理后，能够显著抑制LPS 诱导的IL-1β（P=0.000）、IL-6（P=0.000）、IL-12（P=0.0016）、CCL2（P=0.000）和TNF-α（P=0.022）的mRNA水平的升高（图2）。

图1 不同浓度甘露糖对RAW246.7细胞增殖的影响Fig.1 The effects of different concentrations of mannose on the proliferation of RAW246.7 cells

2.3 不同浓度甘露糖对炎症因子蛋白水平的影响

图2 不同浓度甘露糖对LPS诱导的炎症因子mRNA的影响Fig.2 The effects of different concentrations of mannose on the mRNA level of inflammatory cytokines induced by LPS

和对照组相比，LPS 能够显著刺激巨噬细胞中IL-1β（P=0.000）、IL-6（P=0.000）、IL-12（P=0.000）、TNF-α（P=0.000）和CCL2（P=0.000）蛋白的分泌（图3）。和LPS 单独处理相比，2 mmol/L 甘露糖能够协同LPS 对巨噬细胞IL-1β（P=0.000 9）、IL-6（P=0.047）、IL-12（P=0.000 9）、TNF-α（P=0.002）和CCL2（P=0.002 2）蛋白分泌的刺激，而20 mmol/L 甘露糖则能够显著抑制LPS 诱导的IL-1β（P=0.002 1）、IL-6（P=0.029）、IL-12（P=0.000 4）、TNF-α（P=0.000 1）和CCL2（P=0.001）蛋白分泌。另外，20 mmol/L 的甘露糖单独处理能够抑制对巨噬细胞中IL-1β（P=0.045）和TNF-α（P=0.008 3）的分泌。

2.4 甘露糖及甘露糖-6-磷酸的作用靶点预测

甘露糖进入细胞后大部分会在己糖激酶的作用下转变成甘露糖-6-磷酸［2］，我们通过网络药理学的方法分析了甘露糖及甘露糖-6-磷酸的潜在作用靶点。结果显示，甘露糖有101 个作用靶点，甘露糖-6-磷酸有12 个靶点，其中有3 个是两者的共同靶点（图4）。另外，通过将化合物和炎症的20个共有靶点导入DAVID 数据库进行通路富集显示，甘露糖及甘露糖-6-磷酸通过和炎症相关的20个靶点影响9 条炎症信号相关通路，分别是：PI3KAkt 信号通路、HIF-1 信号通路、胰岛素抵抗通路、Ras 信号通路、Rap1信号通路、雌激素信号通路、孕酮介导的卵母细胞成熟通路、调节干细胞多能性的信号通路和麻疹相关通路。

图3 不同浓度甘露糖对LPS诱导的炎症因子蛋白的影响Fig.3 The effects of different concentrations of mannose on the protein levels of inflammatory cytokines induced by LPS

图4 化合物-靶点网络Fig.4 Compound-target network

2.5 不同浓度甘露糖对炎症细胞模型信号通路的影响

网络药理学预测显示，进入细胞内的甘露糖及其代谢产物甘露糖-6-磷酸对包括AKT 和STAT3在内的炎症相关蛋白具有潜在作用，接下来我们验证了甘露糖对巨噬细胞中AKT 和STAT3 的磷酸化形式的影响。结果显示，和对照组相比，LPS 能够显著增加AKT（P=0.011）、ERK（P=0.000 7）和p65（P=0.007 8）的磷酸化水平，但对STAT3 的磷酸化水平影响不大（图5）。和LPS处理相比，2 mmol/L甘露糖能够协同LPS增强巨噬细胞中AKT（P=0.000 9）和STAT3（P=0.02）的磷酸化水平，而20 mmol/L 甘露糖则显著抑制LPS 诱导AKT（P=0.0007）、ERK（P=0.002 8）和p65（P=0.000）的磷酸化水平。和对照相比，单独甘露糖处理对巨噬细胞中AKT（P=0.009 5，Man2；P=0.000 6，Man20）、STAT3（P=0.037，Man20）和p65（P=0.024，Man2；P=0.006 8，Man20）的磷酸化水平产生了一定的抑制作用，但对ERK的磷酸化没有明显的影响。

3 讨论

作为葡萄糖C-2 差向异构体，甘露糖往往以多糖形式存在于植物和水果中，在人体血液中的浓度不足葡萄糖的五十分之一［8］。近年来，随着对其生理功能认识的不断加深，发现甘露糖具有抗菌、调节免疫、治疗疾病等多种功能［7-8，13］，受到越来越多的关注和研究。本研究探讨了不同浓度的甘露糖单糖对LPS 诱导的巨噬细胞炎症反应的影响。我们证实低浓度的甘露糖能够促进LPS 诱导的炎症因子的表达，而高浓度的甘露糖则抑制LPS 诱导的炎症反应。机制上，甘露糖对炎症反应的调控是通过p65、STAT3 和ERK 信号通路来进行的。

图5 不同浓度甘露糖对细胞信号通路蛋白的影响Fig.5 The effects of different concentrations of mannose on the signaling pathways

甘露糖对细胞增殖有一定的影响。研究［14］显示，25 mmol/L 的甘露糖处理不同肿瘤细胞48 h 及72 h，能够显著抑制多种肿瘤细胞的增殖。另有研究［8］显示，利用25 mmol/L的甘露糖处理T淋巴细胞48 及72 h，同样能够抑制T 细胞的增殖。和上述研究结果不同，本研究的结果显示，5 mmol/L 以下的甘露糖具有促进RAW264.7 细胞增殖的作用；在5 mmol/L 以上浓度的甘露糖处理下，细胞增殖随甘露糖浓度的增加呈下降趋势。但是，和对照组相比，20 及40 mmol/L 的甘露糖处理并未明显抑制细胞的增殖。可能原因是：①细胞系不同，上述研究所用的细胞为人的肿瘤细胞系和小鼠原代T 淋巴细胞［8，14］，而本研究中所用的RAW264.7 细胞是小鼠巨噬细胞系；②培养基含糖量不同，Zhang在培养原代T淋巴细胞时，培养基中不含葡萄糖［8］，而本研究中所用培养基含有5 mmol/L的葡萄糖，由于葡萄糖的存在，在一定程度上能够促进细胞的快速增殖。本研究的结果证实在随着甘露糖浓度的增加，细胞增殖先升后降，其中可能涉及到不同的作用及其机制。因此，我们选择了两个浓度：一个在细胞增殖上升期的2 mmol/L浓度（低浓度），一个在细胞增殖下降期的20 mmol/L浓度（高浓度）来进行后续的实验，以验证对细胞增殖具有不同作用的甘露糖对炎症反应的影响。

炎症是一种基本的病理过程，是具有血管系统的活体组织对损伤因素所做出的防御反应，其目的是为了确保去除有害刺激并修复受损组织。在炎症反应及相关疾病发生过程中，巨噬细胞作为主要的炎症细胞发挥了重要的作用。在体外实验中，往往以LPS 诱导小鼠RAW264.7 巨噬细胞作为体外炎症细胞模型。LPS 可诱导巨噬细胞产生多种炎性介质、细胞因子和趋化因子等［15］，均可引起和促进炎症反应的发生和发展，所以该细胞模型被广泛用于研究化合物或药物对炎症的影响及机制［12，15-16］。有研究显示，甘露糖具有抑制LPS 诱导的急性肺损伤的作用［9，11］。机制上，甘露糖（1 和10 mmol/L）单糖能够抑制LPS 诱导巨噬细胞的炎症反应进而改善急性肺损伤［11］。和上述研究相同，在本研究中，高浓度的甘露糖（20 mmol/L）则能够显著降低LPS 诱导巨噬细胞中L-1β、IL-6、IL-12、TNF-α 和CCL2 的mRNA 及蛋白的水平。而和上述结果不同的是，我们证实低浓度（2 mmol/L）的甘露糖具有协同LPS 的促炎作用。可能的原因是Xu［11］所用LPS 为1 μg/mL，而在本实验中所用LPS的浓度为50 ng/mL。高浓度的LPS对细胞的刺激过于剧烈，往往会导致细胞对处理因素反应抵抗，而低浓度的LPS 所诱导的炎症模型能够更好的反应处理因素对炎症的影响。

网络药理学是融合网络生物学、计算生物学、多向药理学、分子药理学等多学科的方法，构建“疾病-表型-基因-药物”多层次网络，分析药物或化合物在网络中与特定节点的相互作用关系，从系统、整体角度探索药物与机体相互作用的一门新兴、交叉学科［17］。网络药理学不仅在中药领域中药复方多靶点、多成分、整体性、系统性作用机制研究提供了强力的技术支撑［17-18］，而且还可以用于预测单体化合物的作用靶点及影响疾病进展的相关通路［19］。在本研究中，我们通过网络药理学的方法预测了甘露糖及其主要代谢中间产物甘露糖-6-磷酸的炎症作用靶点。预测显示甘露糖及代谢产物有113 个靶点，其中与炎症相关的有20 个，包括对炎症具有重要影响的AKT 和STAT3。通过炎症靶点与相关信号通路的匹配预测，甘露糖及甘露糖-6-磷酸影响9 条炎症信号相关通路，为甘露糖的后续研究提供了指导。

甘露糖可影响多条炎症反应相关的信号通路。p65 所介导的NF-κB 通路和ERK 信号通路是炎症反应的最为重要的细胞信号通路，其磷酸化水平的增加可直接指示炎症反应的增强［20-21］。有研究［22］显示，甘露糖单糖可抑制成纤维细胞中p65 和ERK的磷酸化进而抑制炎症因子TNF-α 和IL-6 的表达。和上述成纤维细胞中的研究相似，本研究在巨噬细胞中证实，高浓度甘露糖单糖可以显著抑制LPS 诱导的p65 和ERK 的磷酸化水平。这表明，在高浓度的甘露糖抑制炎症反应中，主要是影响了NF-κB 和ERK 通路。此外，AKT 信号通路和STAT3 信号通路在炎症反应中也发挥着重要的作用［21，23-24］。网络药理学预测显示AKT 和STAT3 为甘露糖和甘露糖-6-磷酸的炎症靶点。我们的细胞实验证实，高浓度的甘露糖可显著抑制LPS 诱导的AKT 和STAT3 的磷酸化水平，且单独甘露糖处理可抑制AKT、STAT3 和p65 的磷酸化水平。这说明，至少高浓度的甘露糖抑制炎症作用是通过影响AKT、STAT3和p65通路的活化。

另外，低浓度的甘露糖（Man2）对AKT 和p65活性的影响与LPS+Man2 对上述两个蛋白活性的影响不同。一般情况下，较低浓度的甘露糖进入细胞后可被HK 催化生成M6P，以M6P 形式存在；在较高浓度情况下，会有一部分以甘露糖单体形式存在［2，4，14］。根据网络药理学分析，M6P的靶点之一是AKT。我们的试验证实，单独Man2 可以抑制AKT的活性。此外，有研究显示，AKT 为p65 的上游［25］，AKT 可正性调控p65 的活性。我们推测，Man2 单独处理后抑制了AKT 的活性，进而对p65的活性有了一定的影响。另外，有研究显示，M6P 在PMI 催化下生成果糖6 磷酸（fruct-6-phosphate，F6P），其在磷酸果糖激酶（6-phosphofructo-2-kinase）催化下生成的F1，6-BP 能够促进AKT 的活化［26］。我们推测，在LPS 存在情况下，低浓度的甘露糖在PMI和磷酸果糖激酶催化下转变成F1，6-BP，对LPS 调控AKT 及p65 的活性产生了协同作用。具体机制是否如此，还需要进一步的研究证实。

甘露糖具有较高的安全性。有研究显示，用含有1.1 mol/L（198 g/L）甘露糖的水给小鼠饮用16周，未出现毒副作用［8］。另有研究证实，用含有20%甘露糖的水给小鼠饮用，同时给予20%的甘露糖水200 μL/只灌胃，每周3 次，约10 周，结果对小鼠没有明显的影响［14］。在人体上，通过静脉注射甘露糖维持其血清浓度在2 mmol/L 连续3 周，患者显示出很好的耐受性，没有任何肝脏毒性或肾毒性的征兆［27］。同时，甘露糖已用于治疗尿路感染和先天性糖基化障碍病［2］。这为甘露糖的临床安全应用提供了依据。

综上，不同浓度的甘露糖对LPS 诱导的炎症反应具有不同的作用，低浓度的甘露糖具有协同促进炎症的作用，而高浓度的甘露糖则能够显著抑制炎症反应。本实验的结果为甘露糖临床用于抗炎提供了依据。