癌相关成纤维细胞促进胃癌细胞迁移与侵袭

周 畅，陈伟强，王宇恒，杨晓夏，涂 幸，刘 靖，罗 利

（广东药科大学1.生命科学与生物制药学院；2.护理学院，广东广州 510006）

胃癌是我国第二大恶性肿瘤，是导致癌症相关死亡的第三大原因［1-2］。转移是导致胃癌治疗失败的原因之一，转移不仅与肿瘤自身有关，更与肿瘤细胞所处的微环境相关［3-4］。肿瘤微环境包括细胞外基质和多种间质细胞。肿瘤相关成纤维细胞（cancer associated fibroblasts，CAFs）是间质细胞中最丰富的细胞类型［5］。临床数据显示CAFs与胃癌预后密切相关［6］。然而CAFs对胃癌细胞转移能力的影响及相关机制仍未明确。胃癌转移是复杂的演变过程，“上皮-间质”转化（epithelial-to-mesen⁃chymal transition，EMT）是影响转移的重要因素［7］。EMT 指上皮细胞向成纤维细胞表型的转变并获得迁移的能力［8-9］。E-钙粘蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、N-钙粘蛋白（N-cadherin）是上皮-间质转化的重要标志物［10］。E-cadherin 可介导细胞粘附，抑制肿瘤转移［11］。Vimentin 和N-cadherin是间质细胞中的中间丝蛋白，参与细胞运动的调节［12-13］。有研究表明肺癌CAFs 内高表达EMT 相关基因，提示两者存在相关性［14］。另有报道显示CAFs 可诱导前列腺癌和乳腺癌细胞的EMT 进程［15-16］。但有关CAFs对胃癌细胞EMT 影响的研究较少。在本研究将通过细胞功能实验评估CAFs对胃癌细胞迁移和侵袭的影响；CAFs 作用于胃癌细胞后，通过光学显微镜观察胃癌细胞形态变化；通过荧光定量PCR 检测胃癌细胞中EMT 相关指标变化，以此证实CAFs 的促癌作用与胃癌中EMT 进程激活有关。

1 材料与方法

1.1 材 料

胃癌细胞株AGS 及MGC803 购自中国科学院上海细胞库；1640 培养基、DMEM/F12 培养基、PBS缓冲液、青链霉素、胎牛血清及胰酶均购自美国Hycolon 公司；DNA 酶、Ⅳ型胶原蛋白酶、透明质酸酶购自美国Sigma 公司；Vimentin 抗体、Alexa-Fluor 594 结合山羊抗兔IgG（H+L）二抗购自美国Proteintech 公司；DAPI 购自北京索莱宝公司；Trizol裂解液购自广州英伟创津公司；qRT-PCR 引物由武汉谷歌生物公司合成；qRT-PCR 检测试剂盒购自瑞士罗氏公司；细胞周期试剂盒购自上海碧云天公司；8.0 μm Transwell 小室购自美国康宁公司。

1.2 方 法

1.2.1 细胞培养 经广东药科大学临床医学伦理委员会的批准，收集3 例胃癌手术患者的肿瘤组织及相配对的正常粘膜组织（距离肿瘤组织最近边缘＞5 cm），分别用于培养CAFs 及NFs。配置含DNA 酶溶液（2 mg/mL）、透明质酸酶溶液（20 mg/mL）、IV 型胶原蛋白酶溶液（20 mg/mL）、1%青霉素-链霉素双抗溶液、10%FBS的DMEM/F12培养基的组织消化液。在超净台内用含1%青霉素-链霉素双抗的PBS 溶液清洗组织块3次，剪碎组织块至1 mm3大小并加入组织消化液充分进行组织裂解。裂解液经筛网过滤，收集滤液离心（2 000 r/min，r＝10 cm，10 min），弃上清，用含20% FBS 的DMEM/F12 培养基重悬细胞，并接种于24 孔细胞培养板内，在37 ℃，体积分数为5%CO2培养箱中培养。待细胞贴壁生长至融合度达到80%，用2.5 g/L 胰蛋白酶消化细胞进行传代。第3 代传代后细胞可用于后续实验。待细胞贴壁生长至融合度达到90%，弃去培养基，PBS 溶液清洗2 次，加入无血清的DMEM/F12 培养基。培养48 h 后，收集两种细胞的培养液并离心（2 000 r/min，r＝10 cm，10 min），吸取上清冻存于-80 ℃冰箱。实验前解冻上述细胞培养液并加入10%FBS，此时获得两种细胞的条件培养基（NFs-CM、CAFs-CM）。胃癌细胞AGS 和MGC803 采用含10%FBS 的1640 培养基，在37 ℃，体积分数5%CO2培养箱中培养。

1.2.2 免疫荧光实验 2×104个NFs 或CAFs 在24孔板上爬行过夜，在4 ℃下用40 g/L 多聚甲醛固定30 min。预冷的100 μL 0.5%TritonX-100 室温下处理15 min，PBS 洗涤3 次。5% BSA 溶液37 ℃孵箱中封闭1 h，之后加入兔抗人Vimentin 多克隆抗体（1：200）4 ℃孵育过夜。标本中加入Alexa-Fluor 594结合山羊抗兔IgG（H+L）二抗（1∶500）在室温下避光孵育30 min 中，PBS 清洗后，加入DAPI 染色细胞核。最后用荧光显微镜对图像进行观察（放大倍率，200×）。

1.2.3 荧光定量PCR 检测 使用Trizol 试剂从细胞中提取总RNA，RNA 作为模板反转录成cDNA。按照荧光定量PCR 使用说明书检测α-SMA、FAP、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的表达水平，反应条件为∶95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min，72 ℃下延伸34 s，40 个循环，肌动蛋白（Actin）用作内参。引物序列如表1 所示。检测每个模板的CT 值（C 代表周期，T 代表阈值）。2-ΔΔCT法计算基因的相对表达量。实验重复3 次，计算平均值。

表1 检测基因的引物信息Table 1 The primer information of detected genes

1.2.4 细胞周期分析 收集1×106个NFs 和CAFs，PBS 洗2 次后，缓慢加入预冷的70%乙醇溶液中，4 ℃固定过夜。PBS 洗2 次后，加入细胞周期试剂盒中的碘化丙啶染色液（50 ng/mL）/RNase（0.2 mg/mL）/0.1%Triton X-100 混合液重悬细胞，并在37 ℃水浴箱中，避光孵育30 min。采用流式细胞仪检测细胞周期分布。

1.2.5 划痕试验 将5×105个AGS 接种于6 孔板中，用NFs-CM 和CAFs-CM 培养至细胞融合率达90%。MGC823 细胞也进行同样的处理。之后用10 μL 无菌移液管头垂直于培养孔底划3 条平行线，造成伤口。PBS 洗涤脱落细胞，之后加入无血清1640 培养基，置于37 ℃、体积分数为5% CO2培养箱培养，镜下观察0、24和48 h划痕愈合程度（放大倍率，200×）。

1.2.6 Transwell 细胞迁移和侵袭实验 侵袭试验将基质胶用预先冷却的无血清1640 培养基稀释（稀释比为1∶3），将50 μL 稀释后的凝胶加入Tran⁃swell 小室上室面并置入培养箱中2 h，将1×105个AGS用200 μL无血清培养基重悬后，接种于8.0 μm Transwell 小室上室，并将600 μL NFs-CM 或CAFs-CM 加入下室。在37 ℃和5%CO2的培养箱中培养48 h 后，取出Transwell 小室，弃去小室中培养液，PBS 清洗2 遍，在室温下用100%甲醇固定15 min。用棉签擦拭未穿Transwell 小室基底膜的细胞。膜用结晶紫染色15～20 min。迁移实验不铺基质胶，4×104个AGS 加入Transwell 小室上室，其他步骤同侵袭实验。在光学显微镜下选择5 个代表性视野进行拍照计数（放大倍率，200×）。MGC803 细胞迁移与侵袭实验的操作流程同上。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 NFs与CAFs 的分离培养及鉴定

NFs 和CAFs 分别从胃癌手术患者的配对的正常粘膜组织及胃癌组织中分离培养（n=3）。传代第3 代后的NFs 和CAFs 形状均为长梭形；但与NFs 相比，CAFs 多出现胞质突起，排列较紊乱，更易发生融合性生长（图1A）。为了检测NFs 和CAFs 的纯度，我们对这两种细胞株的间质细胞标记物——Vimentin 进行检测。免疫荧光结果显示NFs 和CAFs 均表达Vimentin（图1B）。后对CAFs 的特征性标记物α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和成纤维细胞活化蛋白（FAP）进行检测，荧光定量PCR 结果表明：CAFs 中α-SMA 和FAP 的mRNA 表达水平高于NFs，差异具有统计学意义（α-SMA：t=17.847，P=0.000 058；FAP：t=7.698，P=0.016 456；图1C）。细胞周期实验常常用来反映细胞的增殖能力。流式细胞仪检测细胞周期分布结果显示：与NFs 相比，CAFs 的细胞周期主要分布在S 期，而相应的G1 期在细胞周期实验中减少，差异具有统计学意义（G1：t=3.793，P=0.019 218；G2：t=-3.169，P=0.033 903；S：t=4.379，P=0.011 888；图1D）。这些数据表明我们成功地从正常的胃粘膜组织中分离及培养NFs，并成功地从胃癌组织中分离及培养CAFs。

2.2 CAFs-CM促进GC细胞的迁移和侵袭

为了探索CAFs 对胃癌细胞的迁移和侵袭是否产生影响，我们收集NFs-CM（n=3）及CAFs-CM（n=3）作用于胃癌细胞并进行划痕实验，划痕实验结果显示无论在24 h 还是48 h，CAFs-CM 作用后的AGS 细胞迁移率高于NFs-CM 组细胞，差异有统计学意义（AGS 24 h：t=10.575，P=0.000 452；AGS 48 h：t=-5.270，P=0.006；图2A）。之后再利用Tran⁃swell 小室的方法检测细胞迁移及侵袭能力。迁移实验结果显示与NFs-CM组相比，CAFs-CM能增加AGS 细胞的迁移数量（t=-6.390，P=0.000 211；图2B）。在侵袭实验中，我们观察到与NFs-CM 组相比，当CAFs-CM 作为吸引血清时，AGS 细胞穿过基层胶的数量增加（t=-4.114，P=0.003 372；图2C）。类似的结果也在MGC803 细胞中得到证实。划痕实验结果显示无论在24 h还是48 h，CAFs-CM作用后的MGC803 细胞迁移率高于NFs-CM 组细胞，差异有统计学意义（MGC803 24 h：t=-7.690，P=0.001 538；MGC803 48 h：t=-8.572，P=0.001 017；图3A）。之后再利用Transwell 小室的方法检测细胞迁移及侵袭能力。迁移实验结果显示与NFs-CM 组相比，CAFs-CM 能增加MGC803 细胞的迁移数量（t=-10.826，P=0.000 005；图3B）。在侵袭实验中，我们观察到与NFs-CM 组相比，当CAFs-CM 作为吸引血清时，MGC803 细胞穿过基层胶的数量增加（t=-4.273，P=0.006 741；图3C）。总之，这些数据表明CAFs能促进胃癌细胞的迁移与侵袭。

图1 NFs和CAFs的生长特性与特异标记Fig.1 The growth characteristics and special molecular markers of NFs and CAFs

图2 CAFs体外促进AGS细胞迁移与侵袭Fig.2 CAFs promoted migration and invasion of AGS cells in vitro

2.3 CAFs-CM启动GC细胞EMT过程

为进一步探讨CAFs促进胃癌细胞迁移与侵袭的机制，我们通过光学显微镜镜观察到：与NFs-CM 组相比，CAFs-CM 作用后的AGS 和MGC803 细胞形态均由鹅卵石状的上皮细胞形态变为梭形、纺锤形的间质细胞形态。细胞变细，突起增多。同时，细胞之间的联系变得松散（图4A）。进一步荧光定量PCR 结果NFs-CM 组相比，CAFs-CM 组AGS 和MGC803 细胞中的上皮标志物E-cadherin表达（AGS：t=2.801，P=0.048 767；MGC803：t=5.933，P=0.004 046；图4B）均降低，间质细胞标志 物Vimentin（AGS：t=3.232，P=0.031 910；MGC803：t=-6.382，P=0.003 094；图4B）、N-cad⁃herin（AGS：t=-4.083，P=0.015 060；MGC803：t=-8.073，P=0.001 279；图4B）表达上升。结果表明，CAFs可通过调节EMT过程促进AGS和MGC803细胞的转移。

3 讨论

图3 CAFs体外促进MGC803细胞迁移与侵袭Fig.3 CAFs enhanced migration and invasion of MGC803 cells in vitro

我国是胃癌的高发高死亡地区。大部分胃癌患者就诊时已处于进展期，多数病人易出现转移现象［17］。胃癌的转移是多步骤、多因素参与的极其复杂的过程，其中最重要的一个因素是肿瘤细胞和肿瘤微环境的相互影响。在肿瘤微环境中，活化的成纤维细胞被称CAFs，可通过分泌生长因子和细胞因子作用于肿瘤细胞，促进肿瘤发生生长、血管的形成［18］。但CAFs影响胃癌进展的机制尚不清楚。

本研究成功分离并培养NFs 及CAFs，Vimentin在NFs 及CAFs 中的高表达证实两者具有纤维细胞的特征。尽管CAFs 表现出异质性，但是α-SMA 及FAP 常常被认为是区分CAFs 细胞和NFs 细胞的重要标志物。α-SMA 是肌纤维母细胞的典型标志，也是间质细胞活化的标志。当NFs 与肿瘤细胞接触后，可以自发地转化为α-SMA 高表达的成纤维细胞，从而获得CAFs 的表型特征。并且α-SMA 高表达的CAFs 更容易促进肿瘤的侵袭与转移［19］。FAP 属于丝氨酸蛋白酶，常在CAFs 表面高表达，具有胶原酶活性，能溶解细胞外基质（ECM）促进肿瘤转移［20］。本研究也同样发现α-SMA 和FAP 在所培养的CAFs中呈现高表达，证明所获得的CAFs处于肿瘤刺激下的成纤维细胞活化状态。细胞周期分析表明：CAFs 较NFs的S期分布增加，而G1期分布减少；此结果表明CAFs的增殖率高于NFs，CAFs细胞具有异常增殖的特点。

图4 CAFs调控AGS、MGC803细胞中的EMT变化Fig.4 CAFs caused EMT in AGS cells and MGC803 cells

为了探索CAFs 对胃癌细胞转移能力的影响。我们采用CAFs-CM 与胃癌细胞共培养的方式进行实验，这种培养方式可达到成纤维细胞与胃癌细胞非接触式生长，并保证了细胞间正常信号传导及相互影响，更接近于人体肿瘤微环境。细胞划痕实验证明：与NFs-CM 组相比，CAFs-CM 组创面愈合较快，说明CAFs 促进了AGS 细胞和MGC803 细胞的迁移。同时我们采用Transwell 迁移和侵袭实验研究CAFs-CM 对AGS 和MGC803 细胞迁移与侵袭的作用。我们发现CAFs 能促进AGS 和MGC803 细胞的迁移和侵袭。

最后我们对CAFs促胃癌细胞转移的机制进行了初步探究。EMT 在刺激许多癌症的侵袭性方面常发挥关键作用［8，10，21］。在本研究中，我们观察到与NFs-CM 组相比，CAFs-CM 处理的AGS 细胞和MGC803 细胞逐渐失去细胞间的连接，细胞变得松散，呈现长梭形外观。结果表明，AGS 细胞和MGC803 细胞由上皮细胞向间质细胞形态转化。此外，我们还对EMT 相关基因的表达进行检测。荧光定量PCR 检测表明：与NFs-CM 组相比，CAFs-CM 组上皮细胞标志物E-cadherin 表达下调，而间充质细胞标志物Vimentin 和N-cadherin 表达上调。这些结果证实CAFs 可以通过诱导EMT过程促进AGS细胞和MGC803细胞的生长。

在本研究中，我们成功地分离和培养了NFs 和CAFs。我们发现CAFs 可以通过诱发EMT 反应，促进AGS 细胞和MGC803 细胞的迁移和侵袭。今后，我们将继续深入探究CAFs通过哪些具体的分子信号通路影响胃癌细胞EMT的进程。