高表达趋化因子受体4的脐带间充质干细胞移植治疗急性肝衰竭大鼠的实验研究

邓长卿, 葛来安, 杨裕珍, 何 凌, 潘丽敏,刘小聪, 黄雪云, 刘 琴

(1. 江西中医药大学附属医院, 江西 南昌, 330006;2. 江西省赣州市南康区第一人民医院, 江西 赣州, 341400;3. 江西中医药大学, 江西 南昌, 330006; 4. 南昌大学第二附属医院, 江西 南昌, 330006)

急性肝衰竭是由肝炎病毒、药物、肝毒性物质等多种因素引起的严重肝脏损害，短时间内可出现肝脏细胞大量坏死，导致肝功能严重障碍或失代偿，目前临床仍缺乏特效治疗药物，患者自然死亡率高达80%～90%[1-3]。研究[4-7]发现，干细胞在体外可诱导成为有功能的肝细胞，并且具有促进肝细胞再生、减轻肝脏炎症反应等效果。研究[8]表明，趋化因子受体4(CXCR4)可促进干细胞向损伤肝组织归巢，前期研究[9]也发现肝衰竭大鼠血清可诱导脐带间充质干细胞(UMSCs)高表达CXCR4。本研究通过体外诱导UMSCs高表达CXCR4, 探讨高表达CXCR4的UMSCs对急性肝衰竭大鼠的治疗作用，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及材料

清洁级孕16 d雌性SD大鼠，体质量220～300 g, 用于分离大鼠UMSCs; 清洁级健康SD大鼠60只，体质量220～250 g, 用于肝衰竭模型制备及动物实验，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。主要试剂包括 DMEM-LG培养基(美国Thermo公司)、胎牛血清(美国Gibco公司)、胶原酶Ⅳ(美国Gibco公司)。主要仪器包括超净工作台、恒温细胞培养箱、倒置相差显微镜、低温超速离心机、恒温水浴箱等。

1.2 UMSCs及高表达CXCR4的UMSCs制备

从孕16 d SD大鼠中提取脐带组织，将大鼠脐带洗净、剪碎，依次用0.1%Ⅳ型胶原酶、0.25%胰酶在37 ℃条件下振荡消化，依次用100、200、400目的滤网过滤未消化的组织, 1 200 g离心5 min收集细胞。采用DMEM-LG完全培养基将细胞密度调整为2×106/mL, 取5 mL接种于细胞生长面积为25 cm2培养瓶中，置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养。培养48 h后进行第1次换液，去除未贴壁及死亡的细胞，以后每3～4 d换液，当贴壁细胞达到80%～90%融合时进行传代。高表达CXCR4的UMSCs制备参照前期研究[9]的方法。取第3代UMSCs制成单细胞悬液，调节细胞密度为2×106/mL备用。

1.3 急性肝衰竭大鼠模型的分组治疗

采用D-氨基半乳糖(D-GalN) 1 000 mg/kg联合脂多糖(LPS) 20 μg/kg腹腔注射建立急性肝衰竭大鼠模型。大鼠建模后24 h内死亡15只，将剩下的45只模型大鼠随机分为移植治疗组、移植对照组和空白对照组，每组15只。建模后24、48、96、144 h, 移植治疗组经尾部静脉注入2×106个高表达CXCR4的UMSCs, 移植对照组经尾部静脉注入2×106个UMSCs, 空白对照组经尾部静脉注入等量无菌磷酸盐缓冲溶液(PBS)溶液。

1.4 主要观察指标

① 每天观察并记录各组大鼠的精神状态、食欲状况、运动状况、反应及不良反应等一般情况。② 每天记录各组大鼠的死亡情况，移植治疗后第7天，统计各组大鼠的生存率，并通过GraphPad Prism 5绘制生存曲线。③ 分别在移植治疗后的第3、7天采集各组大鼠静脉血，采用全自动生化分析仪测定不同时点血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)及总胆红素(TBIL)水平。④ 移植治疗后第7天，取各组大鼠的肝脏和肺脏组织，用10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片后苏木素和伊红染色(HE染色法)，光学显微镜下观察肝脏和肺脏组织病理学变化。

1.5 统计学分析

采用SPSS 24.0统计学软件进行数据分析，正态分布的计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析, 2组间比较采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠UMSCs及高表达CXCR4的UMSCs

大鼠UMSCs及高表达CXCR4的UMSCs均呈长梭形，束状密集平行排列，部分呈旋涡状排列，见图1。

大鼠UMSCs

高表达CXCR4的UMSCs

2.2 各组大鼠一般情况比较

D-GalN/LPS腹腔注射后，大鼠逐渐表现为食欲下降，活动明显减少，尿色变黄对外界刺激的反应迟钝，精神萎靡、嗜睡，甚至发展为昏迷状态。治疗后24 h, 各组大鼠一般情况无明显改善; 治疗后48 h, 移植治疗组、移植对照组大鼠一般情况开始有所好转，表现为活动及进食增加，空白对照组大鼠无明显变化。

2.3 各组大鼠生存率比较

移植治疗组、移植对照组、空白对照组7 d生存率分别为 66.7%、53.3%、20.0%, 移植治疗组7 d生存率显著高于空白对照组(P<0.05), 但移植治疗组与移植对照组比较差异无统计学意义(P>0.05), 见图2。

图2 各组大鼠生存曲线比较

2.4 各组大鼠肝功能变化比较

正常大鼠TBIL、ALT、AST分别为(3.70±1.11) μmol/L、(45.83±9.15) U/L、(122.17±10.26) U/L, 建模后24 h的TBIL、ALT、AST分别为(35.85±7.92) μmol/L、(1 405.67±216.60) U/L、(2 207.83±276.88) U/L, 建模前后各指标差异均有统计学意义(P<0.05)。移植治疗后第3、7天，移植治疗组、移植对照组ALT、AST、TBIL水平均显著低于空白对照组(P<0.05), 且移植治疗后第7天，移植治疗组ALT、AST、TBIL水平显著低于移植对照组(P<0.05), 见表1。

表1 各组大鼠ALT、AST、TBIL水平

正常肝脏组织

2.5 各组大鼠肝脏及肺病理组织学检查结果比较

正常大鼠肝小叶结构清楚，无炎性细胞浸润; 建模 24 h 后，肝小叶结构破坏，肝细胞水肿变性坏死，炎性细胞浸润。见图3。移植治疗后第7天，移植治疗组、移植对照组大鼠肝脏组织明显修复，炎性细胞浸润明显减少，且移植治疗组较移植对照组炎性细胞浸润更少; 空白对照组肝小叶结构仍紊乱，肝细胞水肿变性坏死，炎性细胞浸润; 移植治疗组未见肺栓塞、肺纤维化及肺部肿瘤发生。见图4。

建模24 h后肝脏组织

3 讨 论

急性肝衰竭的治疗方法主要有内科综合治疗、肝移植、人工肝、细胞治疗等，其中肝移植的治疗效果最好，但由于肝源短缺、价格昂贵，肝移植不能在临床上广泛开展[1]。肝衰竭患者的预后与损伤后残存肝组织的再生能力密切相关，而肝脏的再生又受到内分泌和旁分泌等途径产生的多种再生因子的共同调控。发生急性肝衰竭时，肝细胞大量坏死，短时间内单纯依靠自身肝细胞再生往往难以完全发挥作用，因此需要进行外源性细胞移植。

UMSCs是来源于脐带的间充质干细胞，其表达间充质干细胞的特异性表面标记物，而且来源充足，取材方便，易于分离、培养，增殖分化能力强，无伦理道德限制。UMSCs的优势使其成为干细胞研究领域的热点，已应用于骨及骨骼肌、肝脏、血液系统等损伤及功能衰竭的治疗[10-11]。

A: 移植治疗组肝脏组织; B: 移植对照组肝脏组织: C: 空白对照组肝脏组织; D: 移植治疗组肺组织。

UMSCs可诱导转化成肝细胞，能合成分泌白蛋白[12]。将UMSCs移植到四氯化碳诱导的肝损伤模型大鼠中，其能整合至肝细胞索而参与肝脏结构的重建[13]。月经血来源的间充质干细胞衍生的外泌体在D-GalN/LPS诱导的暴发性肝衰竭小鼠中具有抗凋亡潜力[14]。人脐带间充质干细胞衍生的外泌体可以有效挽救由四氯化碳诱导的肝衰竭[15]。UMSCs具有的优势及作用为急性肝衰竭的治疗带来了新希望。

CXCR4表达广泛，在骨髓、外周血、肝脏等多种组织干细胞中均有表达，并且是许多成体干细胞的鉴定标记物。荧光示踪显示UMSCs移植后只有少部分归巢到肝脏。有研究[16]表明，肝衰竭患者肝脏胆管上皮细胞高表达基质细胞衍生因子-1(SDF-1), 而SDF-1/CXCR4轴在间充质干细胞向损伤组织归巢中起着重要的作用，表达CXCR4的间充质干细胞可以高效率地沿着SDF-1浓度梯度迁移[17-19]。为了进一步提高UMSCs向损伤肝组织的归巢，本研究采用腹腔注射D-GalN/LPS建立大鼠急性肝衰竭模型，采用肝衰竭大鼠血清体外干预诱导大鼠UMSCs高表达CXCR4, 然后移植治疗急性肝衰竭大鼠。本研究结果显示，与空白对照组比较，移植治疗组、移植对照组ALT、AST、TBIL水平显著升高(P<0.05), 肝脏组织HE染色可见肝小叶结构破坏，肝细胞水肿变性坏死，炎性细胞浸润，提示建模成功。高表达CXCR4的UMSCs移植治疗能显著改善急性肝衰竭大鼠的精神状态、食欲状态、运动状态、反应等一般情况，提高了急性肝衰竭大鼠的生存率，降低了急性肝衰竭大鼠的ALT、AST、TBIL水平，减轻了肝脏的炎症细胞浸润，促进了损伤肝脏组织修复; 同时，移植治疗组大鼠肺组织HE染色未见肺栓塞、肺纤维化及肺部肿瘤等异常病理改变，表明采用高表达CXCR4的UMSCs移植治疗急性肝衰竭是安全的。

综上所述，通过诱导UMSCs高表达CXCR4后再移植治疗急性肝衰竭大鼠安全、有效，可显著减轻急性肝衰竭大鼠肝脏炎症反应和病理损伤，且无肺栓塞等不良反应。