小鼠B细胞亚群及其组织分布的流式细胞检测方法的优化

郭 冉，李芸芊，屠鹏飞，朱枝祥

（北京中医药大学中药学院，北京 100029）

免疫是一种重要的机体防御功能，机体免疫系统通过清除入侵微生物、寄生虫和突变细胞，维持生理功能的稳定。免疫系统主要由免疫细胞和免疫因子组成，根据免疫系统发挥免疫调控作用的方式可分为天然免疫和适应性免疫。天然免疫主要是天然免疫细胞通过识别病原相关模式分子（pathogen-associated molecular patterns，PAMP）或损伤相关模式分子（damage-associated molec⁃ular patterns，DAMP），以低特异性的方式清除大部分病原和损伤细胞[1-5]。适应性免疫是机体针对内外源抗原，激起的特异性免疫反应，最终通过细胞免疫或抗体介导的体液免疫特异清除病原体、病毒感染细胞和突变细胞，并具有免疫记忆功能[6-7]。虽然正常免疫功能对机体防御疾病发挥重要作用，但免疫功能失调也会导致严重的疾病。免疫功能缺陷会导致感染性疾病和肿瘤的发生，对内、外源抗原过度激活的免疫反应会导致自身免疫性疾病和过敏性疾病的发生[8-9]。

免疫细胞中的B细胞包含各种亚群，在天然免疫和适应性免疫中均发挥重要作用，B细胞根据其对抗原的反应特异性一般分为B1a，B1b和B2细胞。B1a细胞在PAMP刺激下直接分泌天然抗体，以低特异性清除一些常见的微生物，主要发挥天然免疫功能；B1b细胞在抗原和细胞因子刺激下以非T细胞依赖的方式分泌抗体，以较高的特异性介导体液免疫功能，但一般无免疫记忆功能[10-11]。B2细胞由骨髓中造血干细胞逐步分化形成原始B细胞（pre-pro-B cells）、祖B细胞（pro-B cells）和前B细胞（pre-B cells）等早期B细胞，然后继续分化为表达B细胞受体（B-cell receptor，BCR）的T1，T2和T3期不成熟B细胞，最后再形成成熟B细胞[12-15]；成熟B细胞在抗原和辅助性T细胞共刺激分子及其分泌的细胞因子刺激下，分化为记忆性B细胞和浆细胞，浆细胞分泌大量高亲和力抗体发挥高特异性体液免疫功能，记忆性B细胞则让体液免疫反应具有免疫记忆功能[16]。

各种B细胞不仅在天然免疫和适应性免疫的体液免疫中发挥重要功能，同时B细胞的功能失调也在自身免疫性疾病和过敏性疾病的发病过程中发挥重要作用。B细胞亚群及其组织分布的准确分析，对开发治疗自身免疫性疾病和过敏性疾病的免疫调控药物的活性评价十分重要[17]。目前，主要利用流式细胞术对B细胞亚群进行定性定量分析。然而，在流式分析中，还缺乏对B细胞亚群表面标志物特异性的深入研究，各种文献报道的B细胞亚群标志物组合差异较大，同时也缺乏对不同组织分布的B细胞亚群流式分析的比较研究[10-16]。本研究通过多种B细胞表面标志物的流式测定，优化各种B细胞亚群的流式测定方法，同时也对各种组织中B细胞亚群进行系统研究，为免疫调控药物活性评价提供研究方法和基础数据。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂和仪器

8周龄雄性BALB/c小鼠6只，购自北京维通利华实验动物有限公司，动物使用许可证号SYXK（京）2016-0038。小鼠在清洁级环境自由饮水进食3 d后用于实验。所有动物实验经北京中医药大学动物实验伦理委员会审批后进行。死细胞染色剂7-氨基放线菌素D（7-aminoactinomycin D，7-AAD）、纯化的大鼠抗小鼠单克隆抗体抗-CD16/CD32（2.4G2）和荧光标记的大鼠抗小鼠单克隆抗体 APC-抗-B220（RA3-6B2）、PE-抗-CD11b（M1/70）、FITC-抗-CD43（S7）、PE-抗-CD138（281-2）及各荧光抗体的同型对照抗体，购自美国BD Biosci⁃ences公司；荧光标记大鼠抗小鼠单克隆抗体PE-Cy7-抗-CD5（53-7.3）、PE-抗-CD93（AA4.1）、PE-Cy7-抗-CD23（B3B4）、APC-Cy7-抗-IgM（RMM-1）、APC-Cy7-抗-CD27（LG.3A10）及各荧光抗体的同型对照抗体，购自美国Biolegend公司；红细胞裂解液（货号：CC051），购自中科迈晨科技有限公司；牛血清白蛋白（货号：V900933），购自美国Sigma-Aldrich公司；其他生化试剂，购自北京化工厂。5424R台型离心机，购自德国Eppendorf公司；FACSCantoTMⅡ流式细胞仪，购自美国BD Bio⁃sciences公司。

1.2 细胞样本制备

利用0.5 mm直径毛细玻璃管穿刺小鼠眼眶后静脉丛，采集外周血到乙二胺四乙酸二钾抗凝管中，取100 μL外周血到2 mL离心管中，加入1 mL红细胞裂解液裂解红细胞，4℃，300×g离心5 min，弃上清，然后重复1次裂解和离心，并弃上清；然后颈椎脱臼处死小鼠，利用注射器向小鼠腹腔注射5 mL细胞培养用磷酸盐缓冲液（0.1 mol·L-1PBS，pH 7.4），轻柔推动小鼠腹腔器官，3 min后，在小鼠腹腔中下部，剪开1个小口，让小鼠腹腔中液体流到5 mL离心管中；再剪开小鼠腹腔，取脾和腹股沟淋巴结，放到40 μm孔径的尼龙滤网上，一边滴加10 mL PBS溶液，一边利用注射器内芯研磨脾和淋巴结组织，制备脾和淋巴结单细胞悬液；最后剪取小鼠一侧股骨，利用1 mL注射器吸取PBS后刺入股骨膝关节端，将骨髓细胞冲洗到2 mL离心管中；在将其他各种细胞悬液吹散后，取1 mL腹腔灌洗液、100 μL脾细胞悬液、2 mL淋巴结细胞悬液、100 μL骨髓细胞悬液到2 mL离心管中（均为5×105～1×106），加入1 mL红细胞裂解液裂解红细胞，4℃，300×g离心5 min，弃上清。从裂解红细胞步骤开始，每只小鼠的每种细胞样本均制备3份。

1.3 荧光抗体孵育

在制备好的外周血细胞、腹膜腔细胞、脾细胞、淋巴结细胞和骨髓细胞中，加入2 mL流式染色缓冲液（含0.2%牛血清白蛋白的PBS）清洗细胞，然后4℃，300×g离心5 min，弃上清，再加入200 μL流式染色缓冲液重悬细胞；每种细胞样本中加入抗CD16/CD32抗体0.5 μg封闭IgG抗体受体，冰浴孵育15 min；然后每只小鼠的每种细胞分别进行3种荧光抗体染色方案：①7-AAD、APC-抗-B220、PECy7-抗-CD5和PE-抗-CD11b染色（主要为区分B1和B2细胞亚群）；② 7-AAD、APC-抗-B220、FITC-抗-CD43、PE-抗-CD93、PE-Cy7-抗-CD23和APCCy7-抗-IgM染色（主要为区分各种不成熟和成熟B细胞亚群）；③ 7-AAD、APC-抗-B220、APC-Cy7-抗-CD27和PE-抗-CD138染色（主要为区分记忆性B细胞和浆细胞亚群）；7-AAD按说明书推荐量加入细胞样本中，各种荧光抗体加入各个样本的量均为0.2 μg，另外设置空白染色管、每种荧光抗体的单标管和3种染色方案的同型对照抗体管，将所有样本与抗体混合均匀后冰浴30 min；最后加入1 mL流式染色缓冲液清洗细胞，4℃，300×g离心5 min，弃去上清，再重复清洗1次，弃上清，加入400 μL流式染色缓冲液重悬细胞。

1.4 流式细胞分析

在将流式细胞仪调试到工作状态后，利用空白染色样本、同型对照样本、每种荧光抗体的单标管样本设置3种染色方案的前向和侧向散射光电压值、7-AAD和各种荧光染色的电压值，然后设置好各荧光通道之间的荧光补偿；最后收集各样本细胞的前侧向散射光和7-AAD及各种荧光抗体染色信号；在测定过程中，通过前侧向散射光设置P1门，以去除细胞碎片和残存的红细胞，收集1×104个P1门细胞的检测信息。

1.5 统计学分析

利用Flowjo7分析流式细胞检测的源文件，分析各种细胞样本中B细胞在总细胞中的比例，同时也分析各种B细胞亚群在总B细胞中所占的比例，并用流式散点图和直方图表示；另外，利用Graph⁃Pad Prism 5.0分析各种组织细胞中的B细胞及B细胞亚群比例平均值的95%置信区间。

2 结果

2.1 外周血中B细胞及其亚群的比例

外周血经2次裂解红细胞和3种荧光抗体染色方案染色后，利用流式细胞术进行测定，通过7-AAD排除易受到非特异性染色的死细胞后，B220+的B细胞占总细胞的25%～58%，B220+CD5+的B1a细胞、B220+CD5-CD11b+的B1b细胞和B220+CD5-CD11b-的B2细胞分别占总B细胞的比例为3.0%～36%，1.8%～2.5%和60%～98%（图1A和D）。B220+CD93+CD23-IgM+的未成熟B细胞和B220+CD93-CD23+IgMlow的成熟B细胞分别占总B细胞的比例为11%～22%和39%～49%（图1B和D）。B220+CD27+CD138-的记忆性B细胞和B220+CD27-CD138+的浆细胞分别占总B细胞的比例为0.2%～8.0%和0.3%～8.8%（图1C和D）。

2.2 腹膜腔中B细胞及其亚群的比例

腹膜腔细胞经离心浓缩、裂解红细胞和3种荧光抗体染色方案染色后，利用流式细胞术进行测定，通过7-AAD排除容易受到非特异性染色的死细胞后，B220+的B细胞占总细胞的40%～57%，B220+CD5+的B1a细胞、B220+CD5-CD11b+的B1b细胞和B220+CD5-CD11b-的B2细胞分别占总B细胞的比例为26%～91%，1.1%～27%和7.6%～46%（图2A和D）。B220+CD27+CD138-记忆性B细胞和B220+CD27-CD138+的浆细胞分别占总B细胞的比例为1.2%～2.8%和1.1%～2.8%（图2C和D）。

2.3 脾中B细胞及其亚群的比例

Fig.1 Percentages of B cells and B-cell subgroups in peripheral blood of mice analyzed with flow cytometry.Peripheral blood was collected and red cells were depleted by osmotic lysis.The remaining cells were stained with three combinations of fluores⁃cent dye and fluorescent-conjugated antibodies.A：7-AAD，APC-anti-B220，PE-Cy7-anti-CD5 and PE-anti-CD11b；B：7-AAD，APC-anti-B220，FITC-anti-CD43，PE-anti-CD93，PE-Cy7-anti-CD23 and APC-Cy7-anti-IgM；C：7-AAD，APC-anti-B220，APC-Cy7-anti-CD27 and PE-anti-CD138；D：percentages of B cells in total cells and percentages of B-cell subgroups in B cells.PC：plasma cells.

Fig.2 Percentages of B cells and B-cell subgroups in peritoneal cavity of mice analyzed with flow cytometry.Cells in the peritoneal cavity were collected with 5 mL PBS lavage，and red cells were depleted by osmotic lysis.The remaining cells were stained with three combinations of fluorescent dye and fluorescent-conjugated antibodies.A：7-AAD，APC-Anti-B220，PE-Cy7-anti-CD5 and PE-anti-CD11b；B：7-AAD，APC-anti-B220，FITC-anti-CD43，PE-anti-CD93，PE-Cy7-anti-CD23 and APC-Cy7-anti-IgM；C：7-AAD，APC-anti-B220，APC-Cy7-anti-CD27 and PE-anti-CD138；D：percentages of B cells in total cells and percentages of B-cell subgroups in B cells.

脾经研磨制备为单细胞悬液并裂解红细胞后，通过3种荧光抗体染色方案染色，然后利用流式细胞术进行测定，通过7-AAD排除易受到非特异性染色的死细胞后，B220+的B细胞占总细胞的52%～61%，B220+CD5+的B1a细胞、B220+CD5-CD11b+的B1b细胞和B220+CD5-CD11b-的B2细胞分别占总B细胞的比例为13%～19%，2.1%～3.1%和79%～85%（图3A和D）。B220+CD43-CD93+CD23-IgM-的Pre-B细胞、B220+CD43-CD93+CD23-IgM+的T1 B细胞、B220+CD43-CD93+CD23+IgM+的T2 B细胞、B220+CD43-CD93+CD23+IgMlow的T3 B细胞、不成熟B 细胞（T1+T2+T3）、B220+CD43-CD93-CD23+IgMlow的成熟B细胞和B220+CD43-CD93-CD23-IgM+的边缘区 B细胞（marginal B）等7种B细胞亚群分别占总B细胞的比例为0.19%～0.74%，3.7%～4.0%，1.8%～2.7%，0.38%～0.76%，6.2%～7.1%，54%～59%和6.5%～11%（图3B和D）。B220+CD27+CD138-的记忆性B细胞和B220+CD27-CD138+的浆细胞分别占总B细胞的比例为2.0%～3.4%和0.9%～1.2%（图3C和D）。

2.4 淋巴结中B细胞及其亚群的比例

腹股沟淋巴结经研磨制备为单细胞悬液并裂解红细胞后，通过3种荧光抗体染色方案染色，然后利用流式细胞术进行测定，通过7-AAD排除容易受到非特异性染色的死细胞后，B220+的B细胞占总细胞的4.6%～36%，B220+CD5+的B1a细胞、B220+CD5-CD11b+的 B1b 细胞和B220+CD5-CD11b-的B2细胞分别占总B细胞的比例为4.6%～26%，1.3%～2.9%和72%～92%（图4A和D）。B220+CD43-CD93-CD23+IgMlow的成熟B细胞占总B细胞的比例为61%～71%（图4B和D）。B220+CD27+CD138-的记忆性B细胞和B220+CD27-CD138+的浆细胞分别占总B细胞的比例为2.6%～3.3%和0.9%～2.6%（图4C和D）。

2.5 骨髓中B细胞及其亚群的比例

Fig.3 Percentages of B cells and B-cell subgroups in spleen analyzed with flow cytometry.The spleen was dissected，homogenized，and passed through a 40 μm mesh to generate single-cell suspension.Red cells were depleted by osmotic lysis.The remaining splenocytes were stained with three combinations of fluorescent dye and fluorescent-conjugated antibodies.A：7-AAD，APC-anti-B220，PE-Cy7-anti-CD5 and PE-anti-CD11b；B：7-AAD，APC-anti-B220，FITC-anti-CD43，PE-anti-CD93，PE-Cy7-anti-CD23 and APC-Cy7-anti-IgM；C：7-AAD，APC-anti-B220，APC-Cy7-anti-CD27 and PE-anti-CD138；D：percentage of B cells in total cells and percentages of B-cell subgroups in B cells analyzed.

Fig.4 Percentages of B cells and B-cell subgroups in lymph node with flow cytometry.The inguinal lymph node cells were removed，homogenized，and passed through a 40 μm mesh to generate single-cell suspension.Red cells were depleted by osmotic lysis.The remaining cells were stained with three combinations of fluorescent dye and fluorescent-conjugated antibodies.A：7-AAD，APC-anti-B220，PE-Cy7-anti-CD5 and PE-anti-CD11b；B：7-AAD，APC-anti-B220，FITC-anti-CD43，PE-anti-CD93，PE-Cy7-anti-CD23 and APC-Cy7-anti-IgM；C：7-AAD，APC-anti-B220，APC-Cy7-anti-CD27 and PE-anti-CD138；D：percentage of B cells in total cells and percentages of B-cell subgroups in B cells analyzed.

Fig.5 Percentages of B cells and B-cell subgroups in bone marrow analyzed with flow cytometry.The bone marrow cells were flushed out from bone marrow of femur.Red cells were depleted by osmotic lysis.The remaining cells were stained with three combinations of fluorescent dye and fluorescent-conjugated antibodies.A：7-AAD，APC-anti-B220，PE-Cy7-anti-CD5 and PE-anti-CD11b；B：7-AAD，APC-anti-B220，FITC-anti-CD43，PE-anti-CD93，PE-Cy7-anti-CD23 and APC-Cy7-anti-IgM；C：7-AAD，APC-anti-B220，APC-Cy7-anti-CD27 and PE-anti-CD138；D：percentage of B cells in total cells and percentages of B-cell subgroups in B cells.

收集股骨骨髓细胞并吹散为单细胞悬液以及裂解红细胞后，通过3种荧光抗体染色方案染色，然后利用流式细胞术进行测定，通过7-AAD排除易受到非特异性染色的死细胞后，B220+的B细胞占总细胞的29%～46%，B220+CD5+的B1a细胞、B220+CD5-CD11b+的B1b细胞和B220+CD5-CD11b-的B2细胞分别占总B细胞的比例为0.9%～4.6%，5.5%～12%和82%～92%（图5A和D）。B220+CD43+CD93+CD23-IgM-的pro-B细胞、B220+CD43-CD93+CD23-IgM-的 pre-B 细胞、B220+CD43-CD93+CD23-IgM+的T1 B细胞、B220+CD43-CD93+CD23+IgM+的 T2 B 细胞、B220+CD43-CD93+CD23+IgMlow的T3 B细胞、不成熟B细胞（T1+T2+T3）和B220+CD43-CD93-CD23+IgMlow的成熟B细胞等7种B细胞亚群分别占总B细胞的比例为0.8%～3.9%，35%～54%，19%～36%，0.1%～2.4%，0.7%～1.3%，20%～40%和5.9%～8.9%（图5B和D）。B220+CD27+CD138-的记忆性B细胞和B220+CD27-CD138+的浆细胞分别占总B细胞的比例为0.4%～1.6%和0.3%～2.1%（图5C和D）。

3 讨论

通过多参数和多种组织中B细胞及其亚群的流式细胞分析，本研究可以很好地观察到各种B细胞亚群标志物的特异性。对于第①种区分B1a，B1b和B2细胞的染色方案，CD5主要表达在B1a细胞和T细胞表面，CD11b主要表达在B1细胞、粒细胞、单核细胞和巨噬细胞表面。因此，首先要利用B220准确设门圈定B细胞，然后再根据CD5和CD11b确定B1a，B1b和B2细胞。然而，对于腹膜腔B细胞，由于富含B220表达水平低的B1细胞，仅利用B220设门的直方图不易将B细胞和非B细胞区分开，可以通过前侧向散射光去除巨噬细胞群或B220和CD11b二维散点图去除CD11b强阳性的巨噬细胞，再设门确定B1a，B1b和B2细胞的比例。

对于第②种主要区分不成熟和成熟B细胞亚群的染色方案，CD43主要表达于B1细胞、pro-B细胞、中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞上，CD93表达于pro-B、pre-B和各种不成熟B细胞上，CD23表达主要表达于成熟B细胞上，同时也表达于T2和T3期不成熟B细胞上，IgM表达于不成熟和成熟B细胞上，其中T3期B细胞和成熟B细胞表达低水平IgM。在通过B220设门去除非B细胞后，再利用CD93，CD23和IgM的表达情况可以确定各种原始B细胞、不成熟B细胞、成熟B细胞和边缘区B细胞亚群比例。但本研究在这种染色方案中发现几个问题。首先，外周血中不成熟B细胞，主要是约占15%的CD43+CD93+CD23-IgM+细胞，这不同于骨髓中不成熟B细胞，骨髓中B细胞是由CD43+CD93+CD23-IgM-的 pro-B 细胞、CD43-CD93+CD23-IgM-的pre-B细胞和CD43-CD93+CD23-/+IgM+的不成熟B细胞逐次发育而来，外周血中CD43+CD93+CD23-IgM+细胞可能是由骨髓中pro-B细胞进入外周血直接发育而来，在出现IgM表达后CD43还未消失，或者骨髓不成熟B细胞进入外周血后CD43暂时性的表达。其次，脾和淋巴结中存在一种B220+CD43+CD93-CD23+IgMlow的细胞亚群，其可能不是pro-B细胞，而是一种特殊的成熟B细胞亚群或浆细胞样树突状细胞，具体类型还需要进一步研究。第三，CD93较特异表达于pro-B、pre-B和不成熟B细胞，但发现在腹膜腔巨噬细胞上高表达CD93，由于腹膜腔巨噬细胞和B1细胞也同时高表达CD43，因此，第②种染色方案不适合区分腹膜腔中早期发育阶段的B细胞，但可结合第①种染色方案区分B1和B2细胞。最后值得一提的是，在外周血和脾细胞中，有一群特别高表达IgM的成熟B细胞亚群，可能是IgM阳性的记忆性B细胞。

第③种染色方案主要用于区分记忆性B细胞和浆细胞，其中CD27主要表达于记忆性B细胞和T细胞上，CD138主要表达于浆细胞和上皮细胞上，在利用B220准确设门圈定B细胞后，该种染色方案可以较特异性地分析各种组织中记忆性B细胞和浆细胞。除此之外，可以结合第②种染色方案中IgM抗体染色以及IgG抗体染色，进一步对记忆性B细胞进行特异性标记和亚群分类。同时也可以利用更多检测参数提高浆细胞检测的特异性。

综合3种荧光抗体染色方案，本研究特异准确地揭示了各种B细胞亚群在各种组织中的的定量分布情况：外周血中主要包含成熟B细胞和一种特殊的不成熟B细胞；腹膜腔中主要包含B1a细胞和成熟B细胞；脾中主要包含成熟B细胞、边缘区B细胞、T1和T2期不成熟B细胞；淋巴结中主要包含成熟B细胞；骨髓中包含各种发育阶段B细胞，主要包含pre-B细胞和T1期不成熟B细胞，同时也是唯一含有较多pro-B细胞的组织。记忆性B细胞和浆细胞在各种组织中都只占B细胞的较小比例，均≤3%，在外周血、淋巴结和脾中含有相对较高的记忆性B细胞（>2%），在腹膜腔中含有相对较高的浆细胞（1.76%）。另外，特别值得关注的是外周血中CD43+CD93+CD23-IgM+不成熟B细胞和脾及淋巴结中存在的B220+CD43+CD93-CD23+IgMlow的细胞亚群，其更多的细胞特征和功能还需要进一步研究。本研究共检测了6只8周龄雄性BALB/c小鼠的B细胞亚群组织分布，实验个体之间数据变异很小，结果可信度高。当然，如果继续增加实验动物数量和不同性别、不同年龄及种属动物的B细胞亚群组织分布分析，将能为B细胞研究提供更多基础资料。

综上所述，通过不同组织中B细胞亚群及非B细胞亚群表面多种表面标志物表达，可以根据需要检测的具体组织和细胞类型，选择合适的标志物和设门方法进行优化的B细胞亚群分析。如果设备、试剂条件许可及实验需要，也可以利用更多参数进行一次性流式检测分析，在准确分析B细胞亚群及其在各种组织中分布的同时，分析各种B细胞亚群的活化、增殖和细胞内蛋白表达变化，从而更好地用于免疫调控药物活性评价和作用机制研究。