猪源金黄色葡萄球菌分离鉴定及16srRNA基因遗传进化分析

张小冬 郭晓银 王贵平 胡仕凤 尹 崇

（湖南农业大学动物医学院，湖南长沙 410128）

1 前言

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种人畜共患病原菌，在显微镜下呈现葡萄串状。金葡菌可以引起猪多种感染，包括皮肤和组织感染、毒素介导的疾病和细菌性贫血。随着抗生素的应用，细菌耐药性大量增加，甚至出现对已有的抗生素都耐受的“超级细菌”，给临床治疗带来了极大的困扰，严重威胁用药及公共卫生安全。动物是金葡菌的“蓄水池”，调查动物源金葡菌具有重大公共安全和食品安全意义，可对医学上治疗金葡菌感染提供参考依据。本研究对湖南地区规模化猪场采集的300份病料，进行金葡菌的分离鉴定和16Sr RNA基因进化树构建和分析。

2 材料与方法

2.1 样品

2018.10-2019.9湖南地区养猪场采集的样品300份，并做好详细记录。

2.2 主要试剂

血琼脂培养基、冻干兔血浆和甲苯胺蓝-DNA酶平板均购自青岛海博生物技术有限公司；DNA试剂盒购自上海生工有限公司；7.5%氯化钠肉汤培养基/固体琼脂培养基实验室配制。

2.3 主要仪器

PCR仪：美国A B公司；生物安全柜：力康发展有限公司；高速离心机：北京赛智创业科技有限公司；生物显微镜：奥林巴斯工业有限公司。

2.4 金黄色葡萄球菌分离培养

合理处理肺脏和拭子后，加入 7.5%氯化钠肉汤培养基中，置变频摇床37 ℃培养24 h。用接种环取菌液少许，在培养基上进行划线，37 ℃培养24 h，然后挑取单菌落，在7.5%氯化钠固体琼脂培养基上纯化培养获得分离菌，挑取单个菌落革兰氏染色。

2.5 生化试验

分离菌触酶试验、糖（葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖和甘露醇）发酵试验、VP试验、血浆凝固酶试验、溶血试验和耐热核酸酶试验。上述试验判定标准均参考伯杰氏手册，简单描述如下：触酶试验中有气体产生，判为为阳性。糖发酵试验和VP试验反应中出现颜色变化判为阳性。溶血试验出现溶血环判为阳性。血浆凝固酶试验在冻干兔血浆生化管中出现凝固现象判为阳性。在耐热核酸酶试验中，甲笨胺蓝-DNA琼脂培养基中的小洞（灌满菌液后培养24h）周围出现淡红色，判为阳性。

2.6 PCR鉴定

提取DNA为模板，用16S rRNA基因和nuc基因扩增分离菌。16s rRNA和nuc引物均由生工（上海）公司合成。将扩增PCR产物经1.0%凝胶电泳后，出现阳性条带的，送去生工测序。测序结果经BLAST分析并构建进化树。

3 结果与分析

3.1 形态学观察

纯化株在固体琼脂培养基上，形成菌落厚不透明的菌落，革兰染色结果显示为直径大小0.8μm左右，单个、成双或成串的葡萄球状的紫色球菌如图1。

图1 分离菌革兰染色（1000×）

3.2 生化试验

生化试验结果见表1。所有分离株触酶试验、糖发酵试验、VP试验、溶血试验和耐热核酸酶试验均为阳性。92.3%的分离株血浆凝固酶试验为阳性。这些结果符合伯杰氏手册（don et al，2014）中对金葡菌生化特性的描述。

3.3 PCR结果

对生化鉴定符合金葡菌生化特性的分离菌，利用16S rRNAPCR扩增，均扩增出1500bp大小的目的片段（图2）。同时用金葡菌特异性基因—耐热核酸酶nuc基因进行PCR检测。

表1 65株分离菌生化结果

均扩增出557bp大小的目的片段（图3）。随机挑选部分菌株进行测序，在NCBI发现与Genbank公布的S.aureus相似度均高于99%，确定为分离菌均为金葡菌。

图2 16s rRNA扩增结果

图3 nuc基因扩增结果

3.4 16S rRNA基因系统发育树

在金葡菌分离株中随机挑选了5株菌株进行测序，BALST后在NCBI上传了序列HN001-005登录号分别为HN650258、MN650259、MN650260、MN650918、MN652637。并进 行了 16S rRNA基因进化树的构建，进化树表明HN001-005分离株与金葡菌的相似性为98.0%-100%，显示分离菌HN001与金葡菌GHA10、分离菌HN002和分离菌HN003与金葡菌HAR1亲缘性最近并在同一进化支上。

3.5 分离结果统计

所有用于分离金葡菌的样品300份均来源于湖南省长沙市等9地（表2）。所有样品中金葡菌总分离率为21.67%，其中肺脏分离率为21.52%，拭子分离率为21.79%；母猪分离率为19.71%，仔猪分离率为23.41%（表2）。建议猪源金葡菌分离的最佳样品为仔猪肺脏和仔猪拭子。

表2 金黄色葡萄球菌菌株分离的统计

4 讨论

猪葡萄球菌感染的主要致病菌为金葡菌。本文根据分离株形态、生化特性和16S rRNA基因以及金葡菌特异性基因—耐热核酸酶基因nuc 合成引物进行PCR反应鉴定为金葡菌。在300份样品金葡菌分离率为21.67%（65/300），其中肺脏分离率为21.52%，拭子分离率为21.79%；母猪分离率为19.71%，仔猪分离率为23.41%。仔猪分离要高于母猪的分离率，这可能是仔猪免疫力低于成年猪，也与养殖场饲养管理条件等因素有关。

金葡菌产生的凝固酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积，从而产生凝固现象。金葡菌形成的感染局部化与此酶有关。金葡菌引起血液感染的危险因素与诱因较多，包括因静脉导管、 气管插管、手术等促使机体屏障功能完整性遭受破坏等导致机体免疫功能下降等多种因素有关。从猪血液中分离金葡菌的报道较少，本研究从猪血液中分离金葡菌，在30份猪血液中金葡菌的分离为0%，可能是样本数较少或该菌并没有侵袭到血液中等，所以在猪身上血液感染金葡菌几率比较低。

16S rRNA是核糖体上小亚基上的RNA，这段序列在不同细菌的结构、功能都具有高度保守性，完成测序后通过BLAST分析可以确定其同源性比较、用于细菌的系统分类鉴定、多样性和亲缘关系分析等。5株金葡菌的16S rRNA基因遗传进化树表明湖南省地区存在着多种不同型的菌株。本研究对湖南省地区猪养殖场采集的样品进行金葡菌的分离鉴定和16S rRNA基因进化树的构建对其感染情况和分布进行了调查，为预防和治疗猪金葡菌的感染提供参考依据。