脱氧雪腐镰刀菌烯醇对动物肝脏组织损伤的研究进展

尚月丽，杨俊花，刘宁，郑江平*

(1. 上海农林职业技术学院，上海 201699；2. 上海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所，上海 201403；3. 河南科技大学动物科技学院，洛阳 471023)

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，又叫呕吐毒素，属于单端孢霉毒素B型，其毒性小于A型，由于其在小麦等食物中含量大，因此大量的研究集中于DON[1]。DON是由禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)、黄色镰刀菌(F.culmorum)和雪腐镰刀菌(F.crookwellense)等霉菌在适宜的温度和湿度条件下产生的一种次级代谢产物，是世界上分布最广泛的真菌毒素之一[2]。大量研究表明，DON在高温170～350 ℃下热稳定，170 ℃持续加热30 min 浓度不减少[3-4]，小麦、燕麦和玉米等粮食作物在加工的各个环节也可能产生DON直接进入畜禽饲料和食品中[5]，导致免疫毒性[6]、生殖毒性，引起肝脏、肾脏等器官的组织病理变化，严重影响动物的生产性能。目前，全球的饲料生产都饱受霉菌毒素污染的威胁，给畜牧业生产带来巨大的经济损失[7]。

肝脏是机体重要的代谢器官，也是DON毒性作用的主要靶器官[2]。然而DON对肝脏组织的损伤作用却存在不一致的报道，可能与动物种属，暴露剂量，暴露时间，生理阶段，还与病理学家对肝脏组织结构的认知及采用的病理评分标准有关[8-10]。本文就肝脏的组织结构特点，DON对肝脏组织结构影响，和DON引起的肝组织损伤的半定量评分做一综述。

1 肝脏组织结构特点

肝脏以肝小叶为单位，典型肝小叶的结构为六边形，中间为中央静脉，六边形的六个角各有一个汇管区，包括小叶间静脉、小叶间动脉、小叶间胆管、神经和淋巴管及间质组织(支持组织)，围绕者汇管区外界，有不连续的肝细胞组成限制板(limting plate)[11]。肝脏的组织结构看似简单，但是经过了近150年的研究，我们对肝脏组织结构的了解仍不够深入，特别是不同种属动物之间的肝组织结构差异还不清楚，例如猪与大鼠、狗和猫的肝脏组织结构就有很大差异[12-13]，这也增加了肝脏病理研究的难度。

2 DON对动物肝脏组织结构的影响

2.1 啮齿动物

用含有3种混合毒素污染的小麦饲喂4周龄大鼠，DON含量约为 (80±5)μg/kg，饲喂28 d，结果没有发现DON对大鼠肝组织形态的影响[14]。但Alexa等[15]研究发现，自然污染DON(含量最高为3 390 μg/kg，平均为2 263.1 μg/kg)的小麦(其中玉米赤霉烯酮含量平均为187.74 μg/kg)饲喂2个月龄的大鼠1个月，肝脏实质明显受到损伤，汇管区结构紊乱，肝细胞表现出明显的毒性反应。以上的影响是否由DON引起，是否与DON的剂量有关？有报道称，在大鼠妊娠6～19 d，每天按照体重0.5、1、2.5和5 mg/kg饲喂DON 1次，到妊娠20 d，发现DON呈剂量依赖性的增加肝细胞胞浆损伤，从肝小叶3区到肝小叶2区都有肝细胞胞浆发生损伤性变化(发生极性变化)[16]，这种变化的描述与后面文章中描述的肝细胞空泡化一致。Abdel-Wahhab等[17]也发现，DON能引起汇管区淤血，汇管区胆管周围纤维性增厚，肝细胞发生脂肪性空泡化，肝细胞核浓缩或者凋亡。这些研究显示，在自然霉菌污染中，单独DON能够引起肝组织病理损伤。

小鼠上的研究结果基本都显示DON对肝组织产生不同程度的影响。4周龄雌性ICR小鼠饲喂DON(玉米中含量3.1 mg/kg)，黄曲霉毒素(玉米中含量597 μg/kg)和玉米赤霉烯酮(玉米中729 μg/kg)，用这样的玉米分别以5%和20%的浓度混合到饲料中，饲喂4周，结果发现肝小叶中心区(3区，中央静脉周围区)肝细胞气球样变性(空泡化)和坏死，同时伴随有轻微的出血[18]。用DON污染小麦原料(饲料中含量为5.89 mg/kg)饲喂4周龄无妊娠、未产仔的ICR小鼠50 d，病理组织检查发现肝脏细胞发生严重的空泡化，脂肪肝和轻度的纤维化[19]。这些研究显示，自然污染的DON毒素能引起肝脏损伤。近年来研究者针对混合毒素较高含量的DON进行单独研究。21日龄雄性昆明小鼠每天进行1次按照体重500 μg/kg灌服DON，30 d后发现小鼠肝细胞发生脂肪空泡化[20]。对断乳7 d后的SPF级昆明小鼠按照体重0.5 mg/kg DON隔日灌胃，60 d后发现小鼠肝脏发生大片脂肪变性(组织切片空泡化)，肝脏上出现局灶性异常坏死区[21]。这两篇研究报道，采用一样的剂量，动物的生理阶段类似，后者暴露时间更久，对肝脏损伤也更严重，说明DON对肝脏的损伤可能存在累积效应，评价安全性可能需要加长暴露时间。对成年雄性C57BL/6小鼠每天用DON分别以1、2.5、25 μg/kg灌胃，连续10 d后发现，25 μg/kg组中央静脉中度扩张，单核细胞浸润，单核细胞在静脉血管周围渗出，肝小叶间间质及汇管区发生碎片化坏死[22]。8周龄的雄性C57BL/6 J SPF级小鼠按照体重25 μg/kg DON每天灌胃发现，灌胃30 d和90 d小鼠肝小叶中央静脉周围均有淋巴细胞积聚[23]。低剂量对肝脏有累积性损伤，那么低于25 μg/kg 的DON暴露更长时间是否存在累积效应引起肝损伤，或小鼠是否存在更敏感的生理阶段，有待进一步探索研究。

2.2 猪

母猪妊娠的35～75 d，每天饲喂自然污染饲料(含DON 4.42 mg/kg和玉米赤霉烯酮0.048 mg/kg)，组织病理学检查并没有发现母猪和胎猪肝脏受损[24]。同样有报道，母猪妊娠35～75 d使用污染饲料，饲料中DON为4.42 mg/kg，也没有发现DON对胎猪肝脏组织形态的影响[25]。给断奶仔猪饲喂DON(饲料中含量为1 mg/kg)和玉米赤霉烯酮(饲料中含量250 μg/kg) 饲喂6周，引起肝脏血管增厚、扩张[26]。用DON(9.57 mg/kg)和玉米赤霉烯酮 (0.385 mg/kg) 污染饲料从妊娠75 d开始到妊娠110 d，以 2.0 kg/d(妊娠75～85 d)，3.0 kg/d(妊娠86～100 d)和3.5 kg/d(妊娠100～110 d)饲喂母猪，检测肝脏组织发现肝小叶间质增厚，肝细胞发生脂肪空泡化[27]。以上报道并不一致，那么混合毒素中DON是否影响肝脏组织结构。单独使用DON发现，在发情前的猪对DON比较敏感，能够引起肝细胞的空泡化和小叶间间质增厚[28]。但是，也有报道显示，单独的DON并不引起肝脏的病理变化，DON与玉米赤霉烯酮和烟曲霉毒素混合饲喂35日龄断奶雌性仔猪，饲喂到35 d才引起肝细胞的脂肪化空泡肝小叶边缘炎性细胞浸润[29]。Pestka等[8]指出，猪是对DON毒性最敏感的动物。不过，从目前的研究看，肝脏是否是DON最敏感的器官，仍需进一步的研究数据支撑。

2.3 禽及其他动物

1日龄雌性火鸡饲喂含DON 20 mg/kg的饲料，到21 d时没有发现DON对肝脏的组织损伤[30]。但是，鸡胚内按照蛋重2 μg/g注射DON，24 h电镜观察，检测到鸡胚肝组织脂滴积聚，48 h检测到肝脏空泡化进一步增加；出生后再次口服暴露DON，电镜观查到脂肪积聚进一步增加，类似人的脂肪肝[31]。断奶德国荷斯坦奶牛饲喂含DON为5.3 g/kg的干物质饲料，11周后肝脏组织活检，电镜和光学显微镜检查，均没有发现DON对肝脏形态的影响[32]。这些报道的观点基本一致，认为禽类与猪、狗和猫比不敏感，但是禽类比反刍动物敏感[8]。

就目前对DON引起肝脏损伤的研究总结来看，对肝脏的损伤并不像是猪最敏感，啮齿动物次之，而似乎是小鼠最为敏感，25 μg/kg的DON就能够引起肝脏组织变化。是否存在不同评价方法对结果的影响还值得研究。

3 DON对肝脏损伤的评分

在上世纪80年代提出了慢性肝炎的半定量评分体系组织活性指数(Histological Activity Index，HAI)并在全世界病理学领域内广泛应用。1995年经ISHAK等[10]对应用中存在的问题进行修改，修改后的HAI能清楚区分肝炎的分期与分级，把肝炎的损伤严重性和进展程度区分开来，且较容易操作如表1、2所示[10]，在慢性肝病尤其是引起炎症坏死的肝脏损伤评分中得到广泛应用[33-34]。随着对DON毒性研究的深入，逐渐由开始的急性高剂量研究转入慢性、低剂量、无症状潜在毒性研究，这也是未来DON影响畜牧生产的主要研究方向[1]。有研究者开始将HAI的方法或思想引到DON对肝脏损伤的病理评分中并加以完善。

表1 修改HAI的分级：炎症坏死评分

据报道，三元杂交猪体重(26.4 ± 4.0)kg饲喂含有DON(3.1 mg/kg)饲料37 d，利用修改的HAI评分对肝脏进行病理评价，发现DON不影响肝脏的病理评分[35]。与之类似，直接利用修改的HAI评分，研究青年三元杂交猪饲料DON慢性污染，DON (4.59 mg/kg) 暴露4周，也没有发现DON对肝脏HAI病理评分的影响[36]。但是，小母猪饲喂污染DON/黄曲霉毒素(5∶1)污染的饲料33 d，送病理实验室对肝脏进行胆管增生、纤维化、水肿性变性、炎症、巨核细胞、坏死、空泡化进行病理评分，结果发现毒素显著增加肝脏的纤维化[37]。雌性1周龄小火鸡饲喂自然污染包含DON、玉米赤酶烯酮和黄曲霉素毒素的饲料到6周龄，对肝脏进行病理评分发现，毒素显著增加肝脏的病理分值[38]。以上报道显示，混合毒素影响肝脏的病理评分，但是利用HAI对DON引起的肝脏病理评分来看，并没有发现DON对肝脏组织损伤的影响。是评分系统需要修改，还是猪肝组织对单独的DON并不敏感，需要进一步验证。

表2 修改后分期：结构改变，纤维化，肝硬化

有部分研究者对HAI进行了大量修改，甚至建立了自己的DON肝损伤评价体系。应用肝脏病理评分来评价分析DON对仔猪肝脏的损伤，依据空泡化、小叶间和汇管区纤维化、胆管增生、局部性髓性血细胞等进行评价，也没有发现DON对肝脏组织结构的影响[39]。但是，Grenier等[40]建立了肝损伤的评分体系表3所示，研究5周龄去势雄性小猪饲喂DON(2.8 mg/kg)5周，从肝损伤的严重性和密度进行病理学评分，结果发现DON严重提高肝脏的病理损伤评分。5周龄去势公猪饲喂DON(98 mg/kg)的饲料,饲喂35 d，利用肝脏病理学评分，发现DON增加了肝脏病理评分[41]。Gerez等[42]建立了肝损伤评分，如表4所示，评价5周龄去势公猪饲喂28 d 含DON(1.5 mg/kg)的饲料，检查猪的肝脏损伤，发现DON处理显著增加肝脏病理评分。5周龄断奶雄性去势仔猪，按体重1 nmol/kg DON 饲喂14 d，然后换0.5 nmol/kg DON饲喂21 d，试验结束采用Grenier等[43]建立的真菌毒素引起猪肝脏损伤的病理学评分标准(如表5所示)[44]，依据表5进行病理评估，结果发现DON显著提高肝脏的组织损伤程度。近来随着肝脏病理半定量评分系统建并发展，较多研究发现DON显著增加猪肝脏的病理损伤评分。完善肝脏的半定量病理评分可能增加了DON对猪肝脏损伤的统计率。

表3 建立肝损伤评分点评价组织损伤

表4 建立一个损伤评分点评价猪组织损伤

表5 建立一个损伤评分点用来评价肝脏组织损伤

小结

综上所述，肝脏是DON毒性作用的主要靶器官，尽管研究的结果不太一致，可能与DON暴露的不同生理阶段，时间长短，剂量，研究者采用的不同研究方法(例如电镜对亚细胞结果的观察可能更加敏感)，也跟研究者所采用不同的半定量肝损伤评分体系，或者只是进行病理组织观察有关。DON对肝脏的长期，低剂量，尤其是敏感的生理阶段例如妊娠期，新生期或者哺乳期是否引起组织细胞的病理学变化有待进一步探讨。妊娠期、新生期和哺乳期，这些敏感阶段(称窗口期)机体在应对持续性炎症反应可能程序化的引起器官组织细胞形态的改变，从而影响后代的生长、健康等。近年来的病理评分体系，较之前有较大的改善，但可能仍需进一步的实践研究及优化，损伤的严重性级别是否更高，在坏死阶段，局灶性溶解性坏死是否更严重，也有待考虑。DON导致的肝损伤常表现为纤维化，在修改后的HAI评分中是分期就是炎症损伤的阶段，并没有在新建评分体系中体现，可能需要进一步优化。本文全面系统的总结肝脏的组织学结构特点和DON对肝脏的病理影响及半定量评分，为DON引起肝脏损伤的病理研究提供参考。