日粮添加发酵豆渣对母猪产仔性能、胎盘效率和胎盘营养物质转运的影响

刘俊泽，赵靓瑜，黄凯，金晓明，李照见，李延森，李春梅

(南京农业大学动物科技学院，江苏 南京 210095)

新生仔猪的体重和健康状况在很大程度上受到子宫内环境的影响[1]。胎儿的生长高度依赖于胎盘，有研究表明，胎儿的体重与胎盘的重量成正比[2-3]。促进营养物质向胎儿的转运是胎盘的重要功能之一[4]。胎儿的生长在很大程度上取决于养分的供应，而养分的供应则取决于胎盘的运输能力。因此，胎盘在调节母胎资源分配，影响胎儿生长和后代的长期健康方面起着至关重要的作用。

妊娠后期是胎儿增重的关键阶段，在妊娠后期对母猪进行营养调控来调节胎盘营养物质转运是提高仔猪初生重的重要手段。多项研究表明，妊娠期添加微生物发酵饲料能够提高母猪的产仔性能。经乳酸杆菌、丁酸梭菌和双歧杆菌发酵的基础日粮提高了母猪的窝产仔数和初生窝重[5]。益生菌发酵饲料提高了母猪的窝产活仔数和初生窝重[6]。在母猪日粮中添加8%的发酵豆粕可以显著提高仔猪的出生窝重[7]。

豆渣是大豆在生产豆奶、豆腐、豆浆等大豆产品时的主要副产物，其营养丰富，含有丰富的脂质、蛋白和膳食纤维[8]。考虑到蛋白质饲料资源的短缺，本试验选择豆渣进行微生物发酵，参与发酵的微生物包括枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、酿酒酵母和粪肠球菌。在本试验中，我们假设发酵豆渣可能会增加胎盘中营养物质转运蛋白的表达，并改善母猪的生殖性能。因此，我们研究了胎盘的生长，母猪的繁殖性能以及胎盘氨基酸、葡萄糖转运蛋白和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路的表达。

1 材料与方法

1.1 试验动物与饲养管理

试验在江苏宿迁立华种猪场进行，根据体况选择24头妊娠85 d的PIC母猪，胎次为4～5胎，随机分为4组，每组6个重复，每个重复1头猪。在试验期间，对照组(CON)饲喂基础日粮，3个处理组饲喂添加了3%(FBD 3)，6%(FBD 6)，9%(FBD 9)发酵豆渣的基础日粮。本试验中使用的发酵豆渣是以40%的豆渣和60%的麦麸作为底物，原料消毒后接种混合菌液，接种比例为6%。混合菌液中嗜酸乳杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌和粪肠球菌比例为2∶2∶1∶1。发酵初始含水量为45%，发酵池密封处理，发酵温度30～37 ℃，发酵时间48 h。发酵豆渣的化学组成如表1所示。

表1 发酵豆渣营养水平

基础日粮根据NRC(2012)配制，发酵豆渣在添加时以湿样形式添加，计算营养水平时以风干水平计算。日粮组成及营养水平见表2。

表2 饲粮组成及营养水平(风干基础)

2)代谢能为计算值，其余为实测值

饲喂从妊娠85 d开始，直到分娩。从妊娠85至111 d，每头母猪每天提供3 kg日粮，在早上7:00和下午3:00分2次饲喂。之后每天饲喂量减少0.5 kg，分娩当天不饲喂。在分娩前一周，将母猪由妊娠舍(长2.2 m×宽0.65 m)转入分娩舍(长2.2 m×宽1.5 m)。

1.2 数据记录与样品采集

在分娩的当天，记录每头母猪生产的仔猪总数，活仔数和仔猪个体重。记录母猪产出第1只仔猪到最后1只仔猪的时间，同时记录出生间隔。测量仔猪体长(每头仔猪枕骨到尾根的距离)。体重指数的计算公式如下[9]：

体重指数(kg/m2) = 体重(kg)/身长(m)2

产出所有胎盘后，记录其重量。平均胎盘重为胎盘总重量和窝产仔猪的比值，包括死胎[10]。胎盘效率为初生窝重和胎盘总重量的比值。将排出的胎盘在室温下彼此分开，随机选取其中3个，平铺在方格纸上(长75 cm×宽50 cm),用中性笔描绘轮廓并计算表面积。收集距脐带约5 cm处的胎盘组织(2 cm×2 cm)并在液氮中速冻，然后在-80 ℃下保存用于RNA提取。

1.3 实时荧光定量PCR分析

用Trizol裂解液提取猪胎盘中的总RNA，并使用NanoDrop 2000 检测其浓度，再使用Takara反转录试剂盒进行合成cDNA。引物参考NCBI中GenBank公布的基因序列，用Primer Premier 5.0软件设计合成，由上海生工生物技术有限公司合成，引物序列见表3。

表3 目的基因及内参基因引物

反应体系为20 μL。目的基因上、下游引物各 0.5 μL(10 μmol/L),SYBY Green real time PCR Master Mix(TaKaRa) 1 μL， DEPC水 8 μL，cDNA 1 μL。PCR反应条件：预变性(95 ℃ 60 s)；扩增(95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 40 s)，40个循环；溶解(95 ℃ 60 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s)。

1.4 统计分析

采用SPSS 20.0统计软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，差异显著时做Tukey组间多重比较；试验结果以平均值和固定效应下的总标准误表示，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 发酵豆渣对母猪的产仔性能和胎盘效率的影响

由表4可知，随着日粮中发酵豆渣含量的提高，体重指数(二次项，P=0.031)呈二次增加趋势，个体胎盘重方面，FBD 9组的个体胎盘重较对照组和其他2个处理组的个体胎盘重显著降低(P<0.05)。FBD 9组的胎盘效率较对照组和其他2个处理组有显著的升高(P<0.05)。日粮中添加发酵豆渣对母猪的产程、产仔间隔、窝产仔数、窝产活仔数、胎盘面积和胎盘总重量没有显著影响(P>0.05)，对仔猪的初生窝重和体长没有显著的影响(P>0.05)。

表4 日粮添加发酵豆渣对初生仔猪状况和胎盘性能的影响

2.2 发酵豆渣对母猪胎盘组织mTOR信号通路的影响

如图1所示，胎盘组织mTOR的mRNA相对表达量在FBD 6和FBD 9组显著高于CON组(P<0.05)，mTOR信号通路中4EBP1的mRNA相对表达量在3个处理组均显著高于CON组(P<0.05)；mTOR信号通路中eIF2αmRNA相对表达量在3个处理组均显著低于CON组(P<0.05)；同时mTOR信号通路中S6K1、eIF4EmRNA相对表达量在FBD 6和FBD 9组中显著高于CON组(P<0.05)；RPS6的相对表达量在FBD 6组显著低于CON组。

字母相同表示不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同图1 发酵豆渣对母猪胎盘mTOR信号通路相关基因mRNA相对表达量的影响

2.3 发酵豆渣对母猪胎盘组织氨基酸转运因子mRNA表达水平的影响

如图2所示，胎盘组织氨基酸转运因子LAT1mRNA相对表达量在FBD 9组显著高于对照组和FBD 3组(P<0.05)。LAT3mRNA相对表达量在FBD 9和FBD 6组显著高于CON组和FBD 3组(P<0.05)。4F2hcmRNA相对表达量在FBD 9 组相对表达量显著高于CON和FBD 3组(P<0.05)，但是和FBD 组差异不显著。SNAT1mRNA相对表达量在FBD 9和FBD 6组显著高于CON组(P<0.05)。

图2 发酵豆渣对母猪胎盘氨基酸转运因子mRNA相对表达量的影响

2.4 发酵豆渣对母猪胎盘组织葡萄糖转运因子mRNA表达水平的影响

如图3所示，胎盘组织葡萄糖转运因子GLUT1mRNA相对表达量在FBD 9组显著高于CON组和其他处理组(P<0.05)。GLUT3mRNA相对表达量在3个处理组均高于CON组(P<0.05)。GLUT4mRNA相对表达量在FBD 6组高于CON组(P<0.05)，但是其他处理组和CON组差异不显著。

图3 发酵豆渣对母猪胎盘葡萄糖转运因子mRNA相对表达量的影响

3 讨论

仔猪初生重依赖于胎盘。有研究报道，胎儿的体重与胎盘的重量成正比[6,11]。在本研究中，FBD 9组的仔猪初生窝重平均值较对照组高了3.8 kg，但是没有达到显著的水平，随着母猪日粮中发酵豆渣含量的提高，仔猪的初生窝重有线性增加的趋势(P=0.057)。但是胎盘总重量以及个体胎盘重的数据却呈现相反的趋势。有报道称当胎盘重量减少时，机体存在着补偿机制来维持胎儿的体重[12]，推测是这种补偿机制发挥了作用。胎盘效率是用来度量每克胎盘产生了多少克的胎儿的单位，是通过胎儿质量与胎盘重量之比来计算的[13]。胎盘效率可以通过改变母体的营养摄入量和组成来改变[14]。发酵豆渣中含有较高含量的酸溶蛋白和益生菌，利于母猪的消化吸收。在本试验中，FBD 9组的胎盘效率要显著高于对照组，表明FBD 9组的母猪以相同重量的胎盘可以生产更高体重的胎儿。因此推测通过在母猪日粮中添加发酵豆渣，改善母猪对营养物质的消化吸收，进而提高胎盘效率。

哺乳动物胎盘的营养物质转运调节主要依赖mTOR信号通路。mTOR信号通路整合母体各种调节生长的信号，包括生长因子、压力、能量水平、氧气和氨基酸[15]。mTOR信号通路在胎盘滋养层细胞的微绒毛膜接收母体信号，并将信息传递至下游以改变基因转录和蛋白质翻译，从而导致涉及胎儿生长的营养转运蛋白的表达发生改变。在本试验中，母猪日粮添加6%和9%的发酵豆渣均使mTOR下游相关基因发生了显著的变化，所以我们进一步对母猪胎盘滋养层细胞营养转运相关因子进行检测。

胎盘效率高表明胎盘营养运输效率较高[16]，葡萄糖和氨基酸是胎儿生长所必需的大量营养素，每种营养素都通过特定的转运蛋白穿过胎盘合体滋养层细胞。胎盘表达超过15种不同的氨基酸转运蛋白，每一种都负责摄取不同的氨基酸[17]。其中研究最多的氨基酸转运系统是系统A和系统L。系统A是依赖钠的累积转运系统，可以将丙氨酸、丝氨酸和甘氨酸之类的中性小氨基酸转运到细胞中。妊娠晚期的胎盘表达系统A的3种亚型：SNAT1、SNAT2和SNAT4。系统L是用于转运大型中性氨基酸的交换器，它将非必须氨基酸交换为带有分支或大侧链的主要必需氨基酸。系统L主要包括以下4种亚型：LAT1、LAT2、LAT3和4F2hc。对胎盘氨基酸转运因子mRNA的定量结果显示，日粮中添加9%发酵豆渣，提高了母猪胎盘中氨基酸转运载体LAT1、LAT3、4F2hc和SNAT1的mRNA相对表达量。表明母猪胎盘转运氨基酸的能力得到了改善。

葡萄糖是胎儿和胎盘生长所需的主要能量底物。胎儿的糖异生很少[18]，所以胎儿几乎完全依赖于来自母体的葡萄糖。胎盘葡萄糖转运蛋白的丰度随着胎盘效率的变化而变化。胎盘效率越高，胎盘中葡萄糖转运因子的表达量越高，尤其是GLUT1和GLUT3基因的表达[14]。葡萄糖转运蛋白GLUT1和GLUT3是将葡萄糖由母体转运到胎儿的主要转运蛋白[19]。而葡萄糖转运蛋白基因GLUT4与GLUT3具有95%的同源性[20]。GLUT5是一种果糖转运蛋白基因，它能够在快速分裂的胚胎中表达来加强果糖的吸收以进行核酸的合成。在本试验中，母猪日粮中添加9%的发酵豆渣提高了胎盘GLUT1和GLUT3的mRNA相对表达量。表明母猪胎盘转运葡萄糖的能力得到了改善。总的来说，本次试验的结果表明在妊娠后期母猪日粮中添加发酵豆渣可以提高胎盘滋养层细胞氨基酸和葡萄糖转运因子的表达，从而提高胎盘效率。

4 结论

在妊娠后期母猪日粮中，添加9%发酵豆渣可以促进母猪胎盘组织中营养物质转运相关基因的表达水平，促进母体营养向胎儿运输，从而提升胎盘效率，最终提高仔猪初生窝重。