影响绵羊胚胎移植妊娠率的因素分析

韩红叶，李晓双，贾日东，许银梅，马晓菲，孙欢，田树军，4*

(1. 河北农业大学动物科技学院，河北 保定 071000；2. 廊坊市农业农村局，河北 廊坊 065000；3. 涿鹿县农业农村局，河北 涿鹿 075699；4. 河北省牛羊胚胎工程技术研究中心，河北 保定 071000)

胚胎移植是胚胎生物技术的重要组成部分，其中以引进品种和品种改良为主的羊胚胎移植技术研究与应用在近年来发展迅速。胚胎移植实际上是产生胚胎的供体和养育胚胎的受体分工协作共同繁殖后代的过程[1]，胚胎移植在扩大良种覆盖率方面有重要作用[2-3]，被广泛地应用于生产[4]。目前，胚胎移植技术在绵羊与山羊的繁育中已体现出独特的优越性，然而胚胎移植效果并不十分稳定，不同研究团队的移植妊娠率存在较大的差异。研究发现,移植不同等级的桑葚胚和囊胚对胚胎移植妊娠率有显著影响[5]；不论是囊胚还是桑葚胚，其数量对胚胎移植妊娠率也有显著影响[6]；黄体数量则对胚胎移植妊娠率没太大影响[7]。本试验从胚胎因素(胚胎的发育阶段、质量、数量)和受体因素(受体羊卵巢上的黄体数)分析影响绵羊胚胎移植妊娠率的主要因素，为提高绵羊胚胎移植效率提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 供体羊处理

供体羊采用孕激素(P4)+促卵泡生成激素(FSH)+前列腺素(PG)法进行超数排卵。在供体羊发情周期内的任意一天，把孕酮栓(CIDR)放入阴道，并计为第0天，于埋栓的13～15 d，每天早晚各注射1次FSH，进行超排处理，于15 d早晨撤去孕酮栓，同时肌肉注射氯前列烯醇 0.1 mg。供体羊发情后，用种公羊进行自然交配，每间隔12 h配种1次，直至发情结束。在供体羊发情的第6天，采用手术法从子宫角采集胚胎。胚胎采集后，在20～25 ℃的检胚室内，用体视显微镜检胚，并对胚胎发育阶段及其质量进行鉴定。对其桑葚胚进行形态学评分，评分标准参考如下：A级卵裂球对称，不含碎片。B级所含碎片<10%，卵裂球对称或不对称。

1.2 受体羊处理

对受体与供体同时放置孕酮栓，于埋栓第13天早晨注射PMSG 300 IU，于第15天早晨撤去孕酮栓，同时肌肉注射氯前列烯醇 0.1 mg。于撤除孕酮栓后24 h开始，用试情公羊试情，每天早晚各试情1次，并记录撤栓后母羊发情起始情况。

1.3 胚胎的植入

采用手术法，将新鲜胚胎移入同期发情的受体绵羊子宫角内。所移植胚胎的供体发情时间与受体发情时间的误差控制在12 h之内。

1.4 妊娠诊断

在移植胚胎后的第30天，利用B超仪对受体羊进行妊娠检查，计算妊娠率。妊娠率(%)=(妊娠受体数/移植受体数)×100。

1.5 统计方法

试验数据用SPSS 21.0软件进行统计分析，用卡方检验对数据进行差异性分析，P<0.05差异性显著，P>0.05差异不显著。

2 结果

2.1 受体卵巢上的黄体数量对妊娠率的影响

为避免胚胎因素干扰，试验中受体所用胚胎为相同的胚胎发育阶段(桑葚胚)、胚胎数量(1枚)和胚胎质量(A级)，受体卵巢上的黄体数量对妊娠率的影响见表1。结果表明,受体卵巢上分别有1、2和3个黄体，其中有3个黄体的受体移植后妊娠率最高，但组间差异不显著(P>0.05)。

表1 受体卵巢上的黄体数量对移植后妊娠率的影响

2.2 胚胎质量对妊娠率影响

试验中每只受体移植胚胎数量相同(均为1枚)，胚胎发育阶段均为桑葚胚，根据桑葚胚形态学评分的比较，区分出质量不同的胚胎(A级或B级)，胚胎质量对妊娠率的影响见表2。结果表明,桑葚胚A级妊娠率显著高于桑葚胚B级妊娠率(P<0.05)。

表2 胚胎质量对妊娠率的影响

2.3 胚胎数量对妊娠率影响

胚胎处于相同发育阶段和质量等级，移植胚胎数量不同对妊娠率的影响见表3和表4，结果表明，移植2枚A级桑葚胚妊娠率显著高于移植 1枚 A 级桑葚胚妊娠率(P<0.05)；移植2枚B 级桑葚胚妊娠率显著高于移植1枚B 级桑葚胚的妊娠率(P<0.05)。

表3 移植A级桑葚胚数量对妊娠率的影响

表4 移植B级桑葚胚数量对妊娠率的影响

2.4 胚胎发育阶段对妊娠率的影响

在移植胚胎数量(1枚)和质量等级(A级)相同的条件下，胚胎发育阶段对妊娠率的影响见表5，结果表明，胚胎发育阶段桑葚胚与囊胚之间组间差异不显著(P>0.05)。

表5 胚胎发育阶段对妊娠率的影响

3 讨论

成熟卵泡排卵后形成黄体，黄体具有分泌孕酮维持母畜妊娠的作用，因此受体卵巢具有的黄体数越多，妊娠率越高[8]。有试验表明，卵巢上有2枚以上黄体的受体，移植胚胎后产羔率极显著地高于有1枚黄体的受体[9]。但有些结果则显示，受体卵巢黄体数量对其妊娠率没有显著影响[10-12]，这与本试验结果一致。本试验研究结果表明，黄体数对母羊妊娠率没有显著影响。

胚胎发育阶段、胚胎质量及数量的优劣是直接影响胚胎移植成功率的重要因素。本试验在胚胎发育阶段，囊胚与桑葚胚妊娠率差异不显著，这与高志敏等[13]、李俊杰等[14]报道一致。此外，采胚时间宜在供体发情配种后6 d，此时胚胎大多为桑葚胚，有利于胚胎的附植。随着胚胎质量的下降，妊娠率也有所下降。说明高质量胚胎移植后受体的妊娠率较高，更适合子宫内环境，这一结果与一些报道一致[9,15]。有报道认为，A级桑葚胚移植的妊娠率显著高于B级桑葚胚[16]。也有其他试验证明A级桑葚胚是胚胎移植的最佳时期，且受胎率非常高[17-18]。本试验研究也表明，移植入A级桑葚胚妊娠率(72.3%)显著高于B级桑葚胚妊娠率(60.0%)，与上述研究结果一致。同时也就是说明A级桑葚胚时期是最佳移植胚胎的时期。

从移植胚胎数量来看，移植胚胎的数量是决定受胎率和胚胎存活率的关键因素[19-20]。陈建泉等[20]认为，移植2枚胚胎为最好，其中受体移植双胚的妊娠率和胚胎存活率比移植单胚的高10%～15%，且2枚胚胎同时移植到黄体侧，要比分别移植于两侧子宫角的妊娠率高。张金龙等[6]试验结果表明，不论是囊胚还是桑葚胚，均是移植2枚胚胎的妊娠率显著高于1枚胚胎的妊娠率。本试验研究表明，移植1枚A级桑葚胚妊娠率(71.8%)与移植2枚A级桑葚胚妊娠率(82.4%)存在显著性差异；移植1枚B级桑葚胚妊娠率(48.2%)显著低于移植2枚B级桑葚胚妊娠率(58.3%)这与前人试验结果一致[21]。因此在实际生产中，宜将B级桑葚胚移双胚，这样可提高胚胎移植受胎率。

在本试验条件下，胚胎等级、移植胚胎数量是影响绵羊胚胎移植妊娠率的主要因素，而胚胎发育阶段和黄体数量对妊娠率无显著影响。