信号肽序列对A型流感病毒H1N1 HA蛋白表达的影响

郑屠园，李娅慧，周继勇，胡伯里*

(1. 南京农业大学动物医学院，江苏 南京 210095；2.浙江大学动物医学系，农业部动物病毒学重点实验室，浙江 杭州 310058)

血凝素(hemagglutinin, HA)是A型流感病毒(influenza A virus, IAV)的囊膜蛋白，是引发机体感染的重要蛋白之一，对病毒的致病性以及毒力至关重要。此外，HA在病毒感染过程中也发挥着重要作用：IAV通过HA识别在宿主细胞表面受体，进而吸附在宿主细胞上；还可以介导病毒囊膜与宿主细胞膜的融合，促进病毒入胞，完成感染[1]。现如今，共发现了18个HA亚型，其中H1～H16在水禽中流行，H17和H18是从蝙蝠中分离出来的[2]。几乎所有的蛋白质都是在细胞质中合成的，信号肽(signal peptide, SP)是位于新合成蛋白质N端的一段的序列[3]，可以指导蛋白质在胞质的正确转移。在信号肽的引导下，新生蛋白质向内质网转移，当蛋白质进入合适的位置后，信号肽序列被切除[4]。然后蛋白质被接着加工转移，最终到达合适的场所发挥功能。

HA是一个跨膜蛋白，在其N端含有信号肽序列[5-6]。本研究在含Flag标签真核载体N端和C端分别引入H1N1分离株(A/Puerto Rico/8/34)的 HA 序列，构建带有HA信号肽序列的SP-HA-Flag载体和缺失信号肽序列的 Flag-HA载体，并利用Western blot和间接免疫荧光检测H1N1的HA重组蛋白的表达情况，进而分析信号肽的有无对HA表达的影响，期望为HA蛋白功能的深入研究提供一定的基础信息。

1 材料与方法

1.1 菌株、载体及细胞

大肠杆菌DH5α感受态细胞和293T细胞来自本实验室保存细胞。A型流感病毒H1N1 (A/Puerto Rico/8/34)株为本实验室保存材料，通过7～9日龄鸡胚扩毒，病毒的毒价为2.0×107TCID50/mL。

1.2 主要试剂

DL5 000 DNA Marker(TaKaRa公司),Flag鼠单抗(Sigma公司),辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG二抗、FITC标记的羊抗鼠IgG荧光二抗(Kirkegaard & Perry Laboratories公司),基因扩增高保真酶Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase试剂盒和T4 DNA连接酶(南京诺威赞生物科技有限公司)，质粒小提试剂盒(天根生物公司)；其他常用试剂为国产分析纯。

1.3 HA基因的扩增

根据GenBank中A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1)的HA基因(NC_002017.1)的序列设计特异性引物，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 扩增目的基因的PCR引物

1.4 重组质粒的构建

PCR扩增目的基因后，进行清洁回收。回收产物进行双酶切，酶切体系为：质粒或目的片段2 μg、限制性内切酶各2 μL、10 × Cutsmart buffer 10 μL、ddH2O补至100 μL。37 ℃酶切2 h，回收酶切产物，然后利用T4 DNA 连接酶连接。16 ℃连接过夜，取连接产物转化DH5α感受态细胞，在含有抗性的LB固体平板上37 ℃过夜培养。挑取单克隆菌落进行菌液PCR鉴定，选取1～3个阳性克隆，送南京通用生物技术有限公司进行测序。将测序比对正确的菌株进行保种以备后续试验使用。

1.5 Western blot 检测HA蛋白表达

293T细胞接种至六孔板中，待其贴壁长至密度为50%～60%时，利用Exfect 2000转染试剂转染相应质粒，转染后6～10 h更换培养液为含2% 血清的DMEM，继续培养至24 h。收集细胞沉淀制样，进行SDS-PAGE后，转印至NC膜，于5% 脱脂奶中室温封闭2 h，用PBST洗膜3次，洗膜完成后根据蛋白Marker大小，剪取所需蛋白大小的膜至稀释好的Flag鼠单抗中，4 ℃孵育过夜。捞取膜用PBST清洗5次后置于5% 脱脂奶稀释的HRP-YKS二抗中于37 ℃孵育1 h，再次用PBST清洗5次。利用ECL 化学发光检测试剂盒进行化学发光显色，检测蛋白表达情况。

1.6 间接免疫荧光检测HA在细胞内的定位

293T细胞接种至共聚焦小皿中，待其贴壁长至密度为50%～60%时，利用Exfect 2000转染试剂转染重组质粒，转染后6～10 h更换培养液为含2%血清的DMEM，继续培养至24 h。除去上清液，加入1 mL 4% 的多聚甲醛固定液，室温固定15 min。弃去固定液后，用含5% 脱脂奶的PBS溶液于37 ℃ 封闭30 min。加入5% 脱脂奶稀释的一抗，于37 ℃ 结合2～4 h。PBS清洗细胞3～5次，再加入5% 脱脂奶稀释的二抗，于37 ℃ 结合1 h。PBS清洗细胞3～5次，用PBS稀释DAPI，于室温孵育细胞10 min。最后观察蛋白在细胞内的定位。

2 结果

2.1 HA基因扩增及质粒的构建

信号肽引导蛋白进入内质网加工后会被切除，为了避免因信号肽切除而丢失检测标签，将标签蛋白置于HA基因蛋白的C端，成功构建了含有信号肽的SP-HA-Flag载体，菌液PCR鉴定结果如图1A所示。接着又构建了不含有信号肽序列的Flag-HA载体，菌液PCR鉴定结果如图1B所示。菌液PCR所得条带均与阳性对照条带的分子量大小相符。

M. DNA Marker (DL5000);1～8. PCR产物;-. 阴性对照;+. 阳性对照图1 重组载体菌液PCR鉴定结果

2.2 信号肽对HA蛋白表达的影响

获得测序正确且含有信号肽的SP-HA-Flag质粒和不含信号肽的Flag-HA质粒后，将其转染293T细胞24 h。收取细胞样品，利用Western blot分别检测蛋白表达情况，结果如图2A、图2B所示，蛋白大小存在明显差异，并且含有信号肽的HA蛋白表达量低于不含信号肽的HA蛋白表达量。

M．未预染的蛋白分子质量标准；1. HA蛋白图2 Western blot鉴定重组蛋白表达情况

2.3 信号肽对HA蛋白在细胞内定位的影响

为了研究信号肽对HA蛋白定位的影响，进行了间接免疫荧光试验，检测HA在细胞内的定位情况。结果发现，含有信号肽序列的HA蛋白主要集中在胞膜位置(图3A)，而不含信号肽的HA蛋白主要分布在细胞质中(图3B)。此外，与图2结果一致的是含有信号肽的SP-HA-Flag蛋白表达量低于不含信号肽的Flag-HA蛋白表达量。

A．SP-HA-Flag；B．Flag-HA图3 荧光显微镜检测重组蛋白定位情况

3 讨论

流感病毒是造成养禽业重大损失的主要病毒之一，如果防控不当就会造成巨大的经济损失。HA是流感病毒不可或缺的功能性蛋白，病毒通过HA结合宿主受体进入细胞，参与病毒感染过程。Flag标签通常不会影响目的蛋白的功能[7]，本文成功构建含有Flag标签的HA蛋白，这有助于对HA蛋白进行更好的分析。因此，成功构建的重组载体可以用来进行免疫共沉淀及间接免疫荧光试验，检测外源性表达的病毒蛋白，节省病毒蛋白抗体的经费支出。信号肽位于新生多肽链的N-末端，介导蛋白质向内质网转移。信号肽在序列和长度上各有不同，通常为含有特征性结构的16至30个氨基酸残基(N端带正电荷，具有亲水性；中间部分包含数个疏水残基；C端具有信号肽酶切割位点)[8]。除了可以将蛋白质靶向转运至内质网膜，信号肽还可以调节蛋白质的分泌效率。尽管已有许多关于信号肽控制蛋白的膜定位的研究，但是还没有信号肽对于流感病毒HA蛋白的具体表达定位的分析。

本研究中将H1N1的HA蛋白分别引入pCMV-Flag-N及pCMV-Flag-C载体中，其中前者将Flag标签连接到去除信号肽的HA的氨基端，而后者将Flag标签连接到未去除信号肽的HA蛋白的羧基端，意在探讨信号肽对HA蛋白在细胞中表达的影响。虽然信号肽在引导蛋白到达细胞内合适的位置后会被切除，Western blot结果仍能检测到部分含有信号肽的蛋白，并且大小明显大于不含信号肽的蛋白，表明信号肽在指导HA蛋白合成以及定位后，未发生完全剪切。这可能是由于细胞内的剪切酶活力不足以应对快速合成的新蛋白，这种不完全剪切在外源性表达酵母基因工程产物的过程中也会出现[9]。但引起不完全剪切的具体原因，还需要更多的试验予以探明。荧光显微镜检查结果显示，HA蛋白的信号肽序列会影响HA蛋白在细胞内的定位，其中，含有信号肽的HA主要定位在胞膜上，而不含信号肽的HA主要定位在胞质中。此外，有数据表明信号肽的有无会影响蛋白的表达及分泌情况[10]。本试验Western blot 和间接免疫荧光结果都发现，检测到的含有信号肽的HA蛋白表达量比不含信号肽的HA蛋白表达量少，表明信号肽的存在会减少HA蛋白的表达量，这与苏艳等[11]的报道是一致的。因此在试验过程中可以利用信号肽来控制外源性蛋白的表达，但引起蛋白减少的具体原因还有待研究。

有研究显示，HA信号肽序列部分氨基酸的缺失将会影响HA蛋白糖基化、成熟以及红细胞凝集的功能[12]，而在本试验中发现信号肽会影响HA蛋白的表达及定位，因此在抗病毒药物的研究中可以通过干扰信号肽序列影响HA蛋白的功能, 进而影响子代病毒的产生及传播。总之，在本文中发现信号肽会影响HA蛋白的表达及定位，这为进一步对HA蛋白进行生物学分析奠定了基础。