弓形虫MIC10基因的克隆与表达

张煊承，李航，谢素珠，赵少伟，王浩，张爽，贾立军

(东北寒区肉牛科技创新教育部工程研究中心，延边大学，吉林 延吉 133002)

刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)是一种专性胞内机会性致病原虫，呈世界范围流行，广泛感染几乎所有的温血动物，能够引起严重的人畜共患传染病[1-2]。猫科动物既是其终末宿主，也是其中间宿主之一，科学家们发现弓形虫的中间宿主无选择性，涵盖了各种动物和人[3]。弓形虫基因型分类主要为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型和非典型基因型，并且每种基因型之间差异较大[4]。Ⅰ型虫株的毒性最强，如RH株；Ⅱ、Ⅲ型的致病能力则较弱，如PLK株和PRU株[5-7]。弓形虫其生活史的各个阶段的抵抗力大不相同，滋养体的抵抗力最弱，卵囊的抵抗力则最强，但其每个阶段均具有感染性，对人类的生命健康和畜牧业的发展造成严重的威胁[8]。

微线体蛋白MIC可根据是否具有跨膜结构分为两类，其中微线体蛋白MIC10属于不具有跨膜结构的蛋白。TgMIC10异于其他的MIC蛋白，在虫体的速殖子期和缓殖子期都存在表达，在前者中的含量约为后者的3倍。成熟的MIC10的分子量为18 kD，它的前导肽序列十分长，由58个氨基酸构成，而成熟的诱导肽序列是由9个二谷氨酸重复和1个不完全的重复序列组成，且诱导肽不含有半胱氨酸[9]。针对重组MIC10制造的抗体可以识别天然MIC10，通过间接免疫荧光试验等对MIC10基因蛋白进行定量，可以帮助区分急性感染和慢性感染[10]。本试验对MIC10基因进行克隆和表达，以期为该基因及其转录蛋白的结构、功能分析及临床应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 虫株与血清

Vero细胞、弓形虫RH株由延边大学预防兽医学实验室保存；小鼠抗弓形虫阳性血清、弓形虫阴性血清均由延边大学预防兽医学实验室制备、保存。

1.2 试剂

ExTaq DNA聚合酶、限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DNA marker等均购自大连宝生物工程有限公司；质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自Omega公司；BL21感受态购自于北京全式金生物技术有限公司；虫体DNA提取试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.3 引物的设计与合成

根据GenBank上登录的弓形虫基因序列(XM_002367312.2)，使用Premier 5.0软件设计合成特异性引物，预期597 bp。2条引物5′端分别引入了BamHⅠ和XhoⅠ限制酶切位点。引物由上海英潍捷基有限公司合成。上游引物F1：5′-CGCGGATCC-ATGGCGCTTTCTTCTTTGAACA-3′；下游引物F2：5′-CCGCTCGAGCTACATCGATTTCCTGCGTCT-3′。

1.4 MIC10基因PCR扩增

将获得的弓形虫DNA作为模版，用于PCR反应。PCR反应体系25 μL：模板DNA 1.5 μL，dNTP 1 μL，上下游引物各1 μL，10×Buffer 2.5 μL，Taq酶0.3 μL，去离子水17.7 μL。PCR反应条件：95 ℃进行预变性5 min，94 ℃进行变性1 min，54 ℃退火90 s，30个循环，72 ℃延伸7 min后，4 ℃保存。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

1.5 MIC10基因重组克隆质粒的构建及测序

将PCR产物与pMD-18T载体连接后，转化到感受态细胞，提取重组质粒，进行PCR鉴定和XhoⅠ、BamHⅠ双酶切鉴定，并将鉴定正确的重组克隆质粒进行测序分析。

1.6 MIC10基因原核表达质粒构建

用XhoⅠ、BamHⅠ双酶切PGEX-4T-1原核表达载体，胶回收载体片段。将重组质粒的酶切胶回收产物与PGEX-4T-1载体的酶切胶回收的产物，连接16 ℃过夜。转化到感受态细胞，提取重组质粒并进行PCR鉴定和XhoⅠ、BamHⅠ双酶切鉴定，1%的琼脂糖凝胶电泳检测鉴定结果。

1.7 重组质粒在大肠杆菌中的表达分析

将鉴定正确的重组质粒转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中，IPTG 37 ℃诱导表达。每隔2 h取菌液，离心沉淀，并裂解后，进行SDS-PAGE电泳分析表达产物。以小鼠抗弓形虫阳性血清作为一抗，以辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG作为二抗进行Western blot分析。

2 结果

2.1 弓形虫MIC10基因PCR扩增结果

以弓形虫的DNA为模板，PCR后得到MIC10基因的目的片段。将产物经过1%琼脂糖凝胶电泳后得到597 bp目的条带，扩增条带与预期大小相同。见图1所示。

M. DL 2000 DNA Marker;1、2. MIC10目的基因扩增片段;3. 阴性对照图1 MIC10基因片段PCR扩增结果

2.2 重组克隆质粒鉴定与测序分析

重组质粒pMD18-T-MIC10经PCR鉴定和酶切鉴定，PCR扩增出597 bp的目的片段，见图2所示。经XhoⅠ与BamHⅠ双酶切后，获得约597 bp的目的条带与2 692 bp的载体片段，见图3所示。序列测定分析的结果表明，获得的弓形虫MIC10基因序列与GenBank上弓形虫基因序列(XM_002367312.2)同源性为100%。

M. DL 2000 DNA Marker; 1、2. pMD18-T-MIC10 PCR产物; 3. 阴性对照图2 pMD18-T-MIC10 PCR鉴定

M. DL 5000 DNA Marker; 1、2. pMD18-T-MIC10酶切片段图3 pMD18-T-MIC10双酶切鉴定

2.3 重组表达质粒PGEX-4T-MIC10鉴定

对重组表达质粒PGEX-4T-MIC10进行PCR鉴定和酶切鉴定，PCR扩增出597 bp的目的片段，见图4所示。

M. DL 5000 DNA Marker; 1、2. PGEX-4T-1 PCR产物;3. 阴性对照图4 PGEX-4T-MIC10 PCR鉴定

经XhoⅠ与BamHⅠ双酶切后，获得约597 bp的目的条带和4 969 bp 的载体条带，见图5所示。

M. DL 5000 DNA Marker; 1、2. PGEX-4T-1双酶切片段图5 PGEX-4T-MIC10酶切鉴定

2.4 重组蛋白表达分析

分别取IPTG诱导前样品和诱导后每2 h的样品，进行SDS-PAGE，在约49 kD处出现MIC10基因与载体共同表达蛋白的目的条带，说明重组蛋白表达正确，见图6所示。Western blot分析表明，该蛋白能被小鼠抗弓形虫阳性血清所识别，具有较好的反应原性(图7)。

M.蛋白质 Marker; 1. 诱导前MIC10; 2. 诱导2 h MIC10; 3. 诱导4 h MIC10; 4. 诱导6 h MIC10; 5. 诱导8 h MIC10图6 重组MIC10蛋白SDS-PAGE电泳鉴定

M. 蛋白质 Marker; 1. 诱导前MIC10; 2. 诱导后MIC10; 3. 阴性对照图7 重组MIC10蛋白Western blot分析

3 讨论

作为顶复体门寄生虫，弓形虫和肉孢子虫等一样为专性寄生虫，而且弓形虫为人兽共患病，严重危及人类的生命安全[1]。自弓形虫被发现以来，对它的研究从未中断过，随着分子生物学的发展，弓形虫的感染与致病机制逐渐被明确，但是如何在感染早期及时准确的发现机体被感染仍值得探讨。

弓形虫侵袭和附着宿主细胞靠它的3个主要细胞器产生的蛋白，即棒状体蛋白、致密颗粒蛋白和微粒体蛋白。虫体侵袭过程中最先产生微线体并黏附宿主细胞，随即棒状体释放内容物形成纳虫泡，最后致密颗粒蛋白进入纳虫泡形成纳虫泡膜，完成整个侵袭过程。研究较多的微线体蛋白主要有MIC2和MIC5，MIC2的主要功能是帮助虫体黏附宿主细胞，MIC5则不具有黏附结构，已证实MIC5具有诊断价值，而且与急性弓形虫病患者血中分离到的诊断抗原H4序列相同。

MIC10是微线体蛋白中发现较晚的，但是查阅EST数据库可以发现，MIC10出现频率较高[9]。MIC10的全长序列为198个氨基酸，二级结构主要为α-螺旋，由于缺乏跨膜域，MIC10与宿主细胞受体绑定，因此MIC10可以从感染部位扩散形成循环抗原，而用于弓形虫病的诊断。在速殖子快速增殖的急性感染期MIC10大量表达，蛋白水平远高于其他阶段，因此MIC10可以作为区别急性和慢性感染的主要指标。为了进一步探讨MIC10的功能，制备能够稳定且高效表达MIC10蛋白的表达载体是研究的关键。本试验从NCBI上查阅到弓形虫MIC10基因的碱基序列，用Primer 5.0设计MIC10基因的特异性引物，并在Blast上做了验证，确保了试验所用引物的可靠性。本试验成功扩增了大小为597 bp的MIC10基因片段，构建pMD18-T-MIC10克隆质粒和PGEX-4T-MIC10原核表达载体，经PCR鉴定和双酶切鉴定正确，并在大肠杆菌中成功表达，表达蛋白的分子量约为49 kD。本试验为弓形虫MIC10基因功能的后续研究奠定了基础。