寒泊羊群体中BMPR-IB基因多态性及其对胎产羔数的影响

马晓菲，陈晓勇，刘爱菊，韩红叶，孙欢，李清艳，敦伟涛，孙树春，4，田树军，4*

(1. 河北农业大学动物科技学院，河北 保定 071000；2. 河北省畜牧兽医研究所，河北 保定 071000；3. 河北农业大学科教兴农中心，河北 保定 071000；4. 河北省牛羊胚胎工程技术研究中心，河北 保定 071000)

1994年在澳大利亚布鲁拉美利奴羊群基因组中发现了与多胎性状相关的FecB基因(fecundity booroola，FeeB)[1]，并通过进一步的克隆定位发现其所处区域同人的四号染色体上的骨形态发生蛋白受体IB(bone moorphogenetic IB,BMPR-IB)基因所处区域相同[2]。通过序列分析发现，BMPR-IB基因高度保守的胞内激酶信号区域的第746位碱基处发生了A→G突变，即FecB突变，此突变引起基因所编码蛋白由谷氨酰胺变为精氨酸，导致BMPR-IB受体部分失活，使其天然配体生长分化因子5(growth differentiation 5,GDF-5)和骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic 4,BMP-4)对颗粒细胞类固醇分泌的抑制作用下降，从而使颗粒细胞分化加快，排卵数增多。

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMPs)是来自转化生长因子β超家族(transforming growth factor beta superfamily,TGFβs)中的一类多肽蛋白。BMPs的受体属于TGFβ受体超家族的成员，是一种具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构的膜蛋白受体，分为细胞外区、细胞内区和跨膜区[3]。目前发现的Ⅰ型受体和Ⅱ型受体都参与BMPs信号的传导[4]。当BMPs、Ⅰ型受体与Ⅱ型受体形成复合物后，Ⅱ受体自身首先激活，然后进一步激活Ⅰ型受体的磷酸化；一旦Ⅰ型受体活化后，胞质中游离的受体调节Smads(receptor-activated smad,R-Smad)便向I型受体移动并激活磷酸化[5]。激活后的R-Smads从受体复合物上脱离后，迅速与共介导Smads(common mediator smad,Co-Smad)形成异源复合物，进行移位入核，与靶基因启动子中的特定序列结合从而起到调控的作用[9]。

为了更好地了解BMPR-IB基因与绵羊多胎性状的相关性，国内学者对不同品种绵羊和山羊进行了研究。研究结果表明，以一胎产多羔著称的湖羊为BB型，肉用中国美利奴具有BB、B+、++3种基因型，夏洛莱、陶赛特、萨福克、中国美利奴则仅有++基因型[6]；小尾寒羊中发现了B基因的存在[7]，并证实B基因确实能提高小尾寒羊的胎产羔数[8]；济宁青山羊以高的胎产羔数而驰名，也发现了BMPR-IB外显子区域816 bp处发生了A→G突变，相应的蛋白质由谷氨酰胺变为精氨酸[9]。寒泊羊是以杜泊羊为父本，以小尾寒羊为母本，通过杂交、横交固定、自群繁育等育种过程，历经十余年而培育出的一个肉用绵羊新种群，目前主要分布于河北省部分地区，其生长速度、育肥效果及羊肉品质均优于小尾寒羊[10-11]。然而，目前寒泊羊的胎产羔数却低于小尾寒羊，这在一定程度上限制了寒泊羊中试推广羊只数量的增加及中试范围的进一步扩大。

为此，本文开展了寒泊羊种群中BMPR-IB基因多态性及其对胎产羔数影响的研究，旨在探讨用B基因作为提高寒泊羊胎产羔数性能及其标记基因的可行性，为今后寒泊羊的选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物和试剂

1.1.1 试验动物

选择寒泊羊育种核心群的584只个体进行采血。

1.1.2 主要试验试剂

血液基因组柱式小量提取试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)、2XES Taq MasterMix(北京康为世纪生物科技有限公司)、Sangon Biotech生工引物(上游引物：5′-GTCGCTATGGGGAAGTTTGGATG-3′ 下游引物：5′-CAAGATGTTTTCATGCCTCATCAACACGGTC-3′)、AVaII酶。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取

将新鲜血样加入柠檬酸钠抗凝剂放入4 ℃冰箱进行保存(长时间放置应放入-20 ℃保存)。使用血液基因组柱式小量提取试剂盒进行DNA的提取。提取出DNA置于-20 ℃保存。

1.2.2 PCR扩增与产物检测

PCR体系反应(25 μL):Mix 10 μL、上游引物0.4 μL、下游引物0.4 μL、ddH2O 13.2 μL、模板DNA 1 μL。使用1%的琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行电泳抽检，其中电泳电压为80 V，电流强度为200 mA,时间为30 min。

1.2.3 PCR产物的酶切与RFLP分析

酶切体系：总体积10 μL。Buffer 1 μL、PCR产物3 μL、AVaII 1 μL、ddH2O 5 μL。反应体系：37 ℃水浴消化30 min，反应完毕进行电泳检测。使用3%的琼脂糖凝胶对酶切产物进行电泳，凝胶成像。其中电泳电压为120 V，电流强度为200 mA,时间为30 min。

1.2.4 判定基因型

根据酶切与RFLP分析结果，判定寒泊羊个体的基因型，并调取寒泊母羊的个体产羔记录，分析寒泊羊种群中BMPR-IB基因的多态性及其对胎产羔数的影响效果。

1.3 数据统计

使用EXCEL软件整理数据，计算FecB基因的基因型频率、等位基因频率、多态信息含量(polymorphism information content，PIC)、杂合度(heterozygosity，He)、有效等位基因数(effective number of allele，Ne)，并进行Hardy-weinberg平衡检验；建立线性模型：Yijk=u+Pi+Gj+eijk，其中Yijk为产羔数记录值，u为群体均值，Pi为第i个胎次的固定效应，Gj为第j种BMPR-IB基因型的固定效应，eijk为随机残差效应。使用SPSS软件中的一般线性模型进行分析。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增产物电泳检测结果

FecB基因片段大小为140 bp，电泳结果如图1所示，其PCR扩增产物的电泳条带清晰，与目的基因大小一致，表明PCR扩增产物质量较好。

M. DL800 bp Marker; 1. FecB基因扩增片段图1 BMPR-IB基因PCR扩增产物电泳结果

2.2 酶切产物电泳结果

结果如图2所示，酶切产物的电泳条带清晰。BB基因型仅在110 bp处有一条带；B+基因型有2条带，分别在110 bp和140 bp处；++基因型(野生型)仅在140 bp条处有1条带。

2.3 寒泊羊种群的胎产羔性能

对具有产羔记录的998只次繁殖母羊的胎产羔数进行统计，寒泊母羊胎产羔分布情况如表1所示，胎产1羔的比例较高为48.5%，胎产3羔及以上的比例较低为13.62%。

表1 寒泊母羊胎产羔分布情况

2.4 BMPR-IB基因多态性及群体遗传学分析

根据酶切产物电泳结果，各基因型频率分布情况如表2所示。BMPR-IB基因在寒泊羊群体中有BB、B+和++3种基因类型，其基因型频率以B基因和+的基因频率较高，分别为33.33%和66.67%。

表2 基因型频率分布

BMPR-IB基因在寒泊羊群体中属于中度多态(0.25

表3 FecB基因在寒泊羊群体中的群体遗传学分析

2.5 BMPR-IB基因型对胎产羔数的影响

对基因型明确母羊的胎产羔数情况进行统计，结果如表4所示。无论初产母羊还是经产田羊，BB和B+基因型的平均胎产羔数均高于++基因型；对于所有胎次的产羔数进行统计，BB和B+基因型的平均胎产羔数分别为2.04只和1.93只，++基因型的平均胎产羔数为1.44只。

表4 不同基因型平均胎产羔数

对各变量之间的相关性进行分析,结果如表5所示。胎次与产羔数在0.05水平上显著相关(Sig.<0.05)，且呈正相关；母羊所携带的B基因的数量与产羔数在0.05水平上显著相关(Sig.<0.05)，且呈相关。而胎次与母羊所携带的B基因数量之间并无显著的相关性(Sig.>0.05)。通过以上相关性分析可知，随着母羊胎次以及携带的B基因数量的增加，其产羔数也随之增加。

表5 相关性分析

以胎产羔数为因变量，携带B基因数以及胎次为自变量，使用SPSS软件建立多元线性回归模型，模型拟合情况如表6所示。运用F检验法，在显著水平0.05情况下，线性关系显著(Sig.<0.05)。从相关系数进行检验，R为0.34，拟合优度中等。综上，模型的拟合效果较好。

表6 方差分析

经过拟合度检验之后，进一步得到多元线性回归系数列表，如表7所示。根据对应的系数得到模型预测方程：胎产羔数=0.415×携带B基因数量+0.320×胎次+0.978。根据容差和VIF进行共线性判断可知，模型的共线性不明显(VIF<20)。

表7 多元线性回归系数

对建立的模型残差统计量进行分析，其频率分布直方图和标准正态P-P图如图3和图4所示。由图可以看出，模型的标准化残差基本呈正态分布，散点分布也较为靠近直线，具有较好的方差齐性和正态性。

图3 回归模型回归标准化残差的直方图

图4 回归标准化的正态P-P图

3 讨论

3.1 寒泊羊的胎产羔性能

国内目前缺乏专用的肉用绵羊新品种，地方品种的产肉性能普遍劣于国外的肉用品种。从国外引进肉羊品种与地方品种进行杂交改良，成本高，其后代产羔率低，对粗放的饲养条件也不能很好适应，而且杂交体系较为复杂，在实际生产中易发生乱配现象从而丢失优秀性状。因此，培育符合国情和农区养殖现状的肉用新品种刻不容缓。小尾寒羊繁殖性能优越，杜泊羊产肉性能好，寒泊羊是以小尾寒羊为母本，杜泊羊为父本进行培育，旨在培育兼顾肉用性能和繁殖性能的肉用绵羊品种。近十余年，以多胎基因BMPR-IB作为分子标记进行选育，目的是提高其产羔数，同时对体型外貌进行严格筛选，目的是维持较好的产肉性能。有研究表明，寒泊羊的早期增重显著好于小尾寒羊, 肉用体型较小尾寒羊显著改善[12]，其繁殖性能较杜泊羊也有所改良，能够常年发情配种产羔[13]。对寒泊母羊历年胎产羔数记录进行统计，其胎产羔率平均为168%。虽高于杜泊绵羊平均产羔率(136%)，但仍与小尾寒羊胎产羔率(260%)具有较大的差距。本研究对具有产羔记录的998只繁殖母羊的胎产羔数进行统计，胎产1羔的比例为48.5%，胎产2羔的比例为37.88%，胎产3羔及以上的比例为13.62%，可见目前寒泊羊种群的胎产羔率在个体间存在较大差异，有希望通过增加选择强度的途径来提升胎产羔数及整齐度。

为了满足肉羊集约化舍饲对繁殖母羊胎产羔数不低于2只并且胎产羔数量整齐一致的要求，因此如何有效提升母羊的胎产羔数并缩小寒泊羊胎产率这一繁殖技术指标的变异系数，将成为下一步进行寒泊羊品种选育亟待解决的问题。

3.2 寒泊羊群体中BMPR-IB基因的多态性及群体遗传性分析

BMPR-IB基因作为多胎性状的主效基因,在许多繁殖性能较为优秀的品种中都已被发现。湖羊作为中国特有的多胎品种全为BB型，具有多胎性能的小尾寒羊中也发现了突变型(B基因)的存在，以高的胎产羔数而驰名的济宁青山羊也发现了BMPR-IB外显子区域816 bp处发生了A→G突变[9]。肉用中国美利奴具有BB、B+、++3种基因型，夏洛莱、陶赛特、萨福克、中国美利奴则仅有++基因型[6]。可见，BMPR-IB基因的多态性在不同羊品种间存在较大差异。本研究结果显示，BMPR-IB基因在寒泊羊群体中有BB、B+和++3种基因类型，其基因型频率分别为16.66%、33.34%和50.00%。据此计算，B和+两种基因在寒泊羊种群中的基因频率目前分别为33.33%和66.67%，B基因较+基因的频率明显处于偏低水平。

BMPR-IB基因在寒泊羊群体中处于Hardy-Weinberg不平衡状态，属于中度多态，说明人工以FecB基因为分子标记对寒泊羊进行选育有一定效果。有效等位基因数达到1.8，较为接近等位基因数的绝对值，杂合度0.44较低，说明人工选择压力较大。综上数据说明，多年的选育确实提高了B基因的概率，但目前B基因的概率仍处于偏低水平，需进一步加强选择强度。

3.3 BMPR-IB基因型对胎产羔数的影响

BMPR-IB基因高度保守的胞内激酶信号区域A746G突变，引起细胞内激酶区域的编码蛋白由谷氨酰胺变为精氨酸，导致BMPR-IB部分失活，使其天然配体抑制颗粒细胞类固醇分泌的作用下降，类固醇浓度上升加速了颗粒细胞分化，从而促进了排卵，有利于提高胎产羔数。近年来，许多学者通过对携带FecB基因的高繁殖力母羊进行代谢机制和分子机制的研究发现，携带FecB基因的母羊允许较小的卵泡在促性腺激素分泌抑制期间存活，即更多的卵泡可发育成排卵卵泡[14]，从而显著提高排卵数。本研究通过对繁殖母羊的胎产羔数进行统计也发现，B基因对胎产羔数具有正效应(相关系数为0.415)，且与胎次(相关系数为0.320)对胎产羔数的影响相比效果更加显著，这与前人在其他品种绵羊上得出的结果一致[5，8]。

由此可见，通过增加寒泊羊群体中B基因的频率，有望提升母羊的胎产羔数；可利用B基因作为分子标记开展寒泊羊的品种选育工作，以期提高寒泊母羊的胎产羔数及整齐度。

4 结论

BMPR-IB基因在寒泊羊种群中存在BB、B+和++3种基因类型，其基因型频率分别为16.66%、33.34%和50.00%，B基因对胎产羔数具有正效应。